濃香型白酒大曲在發(fā)酵和成熟過(guò)程中主要功能酶活力分析

王玉霞,李 兵,2,申孟林,2,尹旭敏,郭小麗,陳 橋,張 超,*

(1.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,四川宜賓 644000; 2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039; 3.重慶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,重慶 401329)

白酒是中國(guó)的國(guó)酒[1],具有悠久的歷史,與威士忌、白蘭地、朗姆酒、伏特加和金酒并稱為世界六大蒸餾酒。我國(guó)是世界上利用微生物制曲釀酒最早的國(guó)家,具有世界獨(dú)創(chuàng)性的白酒固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾生產(chǎn)工藝。制曲釀酒技術(shù),經(jīng)歷了幾千年的傳承和發(fā)展,使中國(guó)白酒成為享譽(yù)全球的發(fā)酵酒精飲品[2]。大曲是影響大曲酒釀造最為關(guān)鍵的因素之一,具有糖化、發(fā)酵、酒化和生香等功能,不僅為大曲酒的發(fā)酵、成香提供必不可少的微生物菌群和風(fēng)味前驅(qū)物,還提供發(fā)酵所必需的豐富生物催化劑——酶類[3]。

大曲中的酶類根據(jù)催化功能可分為淀粉酶、蛋白酶、氧化還原酶、酯化酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、單寧酶、裂解酶、果膠酶和異構(gòu)酶等酶類[4]。大曲內(nèi)豐富的功能酶系在釀酒過(guò)程中所起的復(fù)雜作用,是大曲酒品質(zhì)和產(chǎn)量的重要保障,這使得大曲成為我國(guó)白酒釀造過(guò)程品質(zhì)控制的核心指標(biāo)之一。大曲具有“一菌產(chǎn)多酶,一酶源于多菌”的特征,構(gòu)成了大曲復(fù)雜的菌系、酶系基礎(chǔ)[5-7]。

大曲的生產(chǎn)工藝主要包括:原料選配、潤(rùn)糧破碎、壓制成型、接種發(fā)酵和貯存后熟等五個(gè)工序[6],其中后兩個(gè)工序,通過(guò)不同的工藝手段,控制溫度、水分和曲塊內(nèi)部氧氣濃度等各項(xiàng)條件,使其有利于特定風(fēng)格大曲的形成。期間通過(guò)微生物菌群錯(cuò)綜復(fù)雜的發(fā)展演變和更迭交替,最終形成種類繁多而又必不可少的龐大功能酶系。

基于大曲發(fā)酵環(huán)境狀況以及大曲內(nèi)菌群微生態(tài)條件的不斷變化,曲塊表層與內(nèi)部微生物群系的演變更迭,以及微生物產(chǎn)生的功能酶系對(duì)白酒釀造所具有的非凡意義,許多學(xué)者針對(duì)大曲與特定酶活力的研究,主要集中在各酶系的作用、制曲時(shí)間對(duì)酶活力的影響,以及成品曲存放期酶活力的變化和特殊產(chǎn)酶微生物等方面[6,8-9]。如李祖明對(duì)清香和醬香四種成熟酒曲的糖化酶和蛋白酶等活力進(jìn)行了分析比較,結(jié)果顯示不同類型大曲糖化酶和蛋白酶活力變化差異明顯[10]。魯珍等從高溫醬香白酒大曲中分離了高產(chǎn)糖化酶菌株,其中蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)GX06產(chǎn)糖化酶能力最強(qiáng),糖化酶活性可達(dá)917.03 U/g[11]。在眾多大曲酶相關(guān)研究中,針對(duì)濃香型大曲特殊發(fā)酵、成熟工藝,跟蹤同一批大曲,從制作、發(fā)酵到存放成熟過(guò)程中主要酶活力變化規(guī)律,以及與同時(shí)期微生物類群相互對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究,還較為少見(jiàn)。因此,課題組對(duì)大曲制作、發(fā)酵、成熟過(guò)程中主要功能酶活力變化規(guī)律及特定產(chǎn)酶微生物種屬多樣性進(jìn)行了考察。擬通過(guò)對(duì)不同時(shí)期α-淀粉酶、單寧酶、木聚糖酶和脂肪酶活力的測(cè)定,分析曲皮和曲心酶活變化規(guī)律,以期為高產(chǎn)功能酶微生物的利用、制曲工藝的優(yōu)化以及特定加強(qiáng)型功能大曲酶制劑的研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大曲樣品 宜賓傳統(tǒng)濃香型大曲制曲工廠;冰乙酸、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、可溶性淀粉、果膠、酪氨酸、酪蛋白、福林酚試劑、環(huán)己烷、3,5-二硝基水楊酸 均為分析純,成都科龍化工試劑廠。

PB2002-N稱量天平、AB204-E分析天平 Mettler-Toledo公司;Delta 320-S精密pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司;Spectramax-M2酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices;3K冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣及處理 隨機(jī)選擇夏季開(kāi)始制作的某批大曲,全程跟蹤其制作、發(fā)酵和成熟過(guò)程,并在成形、長(zhǎng)霉、起火、大火、后火、養(yǎng)曲、成熟1月、成熟2月、成熟3月和出庫(kù)使用十個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)取樣。在曲房不同位置隨機(jī)挑6塊大曲,每塊大曲沿對(duì)角線分開(kāi),每半塊大曲分別切取表皮往內(nèi)的0～3 cm為曲皮樣、從曲塊的心部往外0～3 cm為曲心樣品,再將其分別粉碎,-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩８鳂悠肪幪?hào)見(jiàn)表1。

表1 樣品編號(hào)及說(shuō)明Table 1 Sample code and detail

1.2.2 大曲宏蛋白酶液的提取 根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法改進(jìn):稱取5.0 g大曲粉,于10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中(0.1 mol/L,pH4.6),4 ℃條件浸提過(guò)夜,4層紗布過(guò)濾,濾液在4 ℃條件下4000 r/min離心10 min,棄去沉淀,上清液即為大曲宏蛋白粗酶提取液,重復(fù)三次,合并提取液于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3α-淀粉酶活力測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法稍作改進(jìn):取1 mL粗酶液于70 ℃保溫15 min后,加入1%(w/v)淀粉溶液1 mL,于40 ℃水浴中保溫反應(yīng)5 min后,迅速冷卻至室溫。取適量酶解液適當(dāng)稀釋后,以DNS法測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖濃度并換算成大曲α-淀粉酶活力,重復(fù)三次。

α-淀粉酶活力定義(U):在40 ℃、pH4.6的條件下,1.0 g大曲1 min分解可溶性淀粉產(chǎn)生1.0 mg麥芽糖所需要的酶量。

α-淀粉酶活力(U)=C×稀釋倍數(shù)×10/5/T/反應(yīng)酶量

式中:C為還原糖濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.4 單寧酶活力測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[14-15]的方法進(jìn)行操作。

單寧酶活力定義(U):在30 ℃、pH5.0條件下,1.0 g大曲1 min分解沒(méi)食子酸丙酯產(chǎn)生1.0 mg沒(méi)食子酸所需要的酶量。

單寧酶活力(U)=C×稀釋倍數(shù)×10/5/T/反應(yīng)酶量

式中:C為沒(méi)食子酸濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.5 木聚糖酶活力測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[16-17]的方法進(jìn)行操作。

木聚糖酶活力定義(U):在40 ℃、pH4.6條件下,1.0 g大曲1 h分解木聚糖產(chǎn)生1.0 mg木糖所需要的酶量。

木聚糖酶活力(U)=C×10/5/T/反應(yīng)酶量

式中:C為木糖濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應(yīng)時(shí)間(h)。

1.2.6 脂肪酶活力測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[18-19]的方法進(jìn)行操作。

脂肪酶活力定義(U):在37 ℃、pH4.6的條件下,1.0 g大曲1 min分解對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯產(chǎn)生1.0 mg對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。

脂肪酶活力(U)=C×10/5/T/反應(yīng)酶量

式中:C為對(duì)硝基苯酚濃度(mg/mL);10為提取的粗酶液量(mL);5為稱取的大曲量(g);T為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0處理分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲α-淀粉酶活力變化情況

大曲制作的原料中含有大量淀粉類物質(zhì),為提供給自然接種后曲塊表層與內(nèi)部微生物生長(zhǎng)繁殖需要,離不開(kāi)原料中淀粉類物質(zhì)的降解,α-淀粉酶能催化淀粉分子內(nèi)部α-1,4糖苷鍵斷裂而獲得還原糖和糊精為微生物提供營(yíng)養(yǎng)[20-21]。實(shí)驗(yàn)對(duì)大曲發(fā)酵與成熟過(guò)程中α-淀粉酶活力變化規(guī)律的分析,結(jié)果如圖1所示。

圖1 大曲α-淀粉酶活力分析Fig.1 α-Amylase activities in the Daqu注:(A):曲皮,(B):曲心;不同小寫(xiě)字母 表示差異顯著(p<0.05),不同大字字母 表示差異極顯著(p<0.01),圖2～圖4同。

圖1數(shù)據(jù)顯示,在整個(gè)考察時(shí)間段內(nèi),曲皮樣品中α-淀粉酶活力變化情況,總體上呈現(xiàn)出先升高再降低,最后趨于平緩的變化趨勢(shì)。在曲塊的發(fā)酵階段(P1～P4),酶活力迅速升高,于大火期(P4)達(dá)到最大值765.78 U,較初始樣品(P1)酶活力提高了8.39倍。進(jìn)入成熟階段后(P7～P10),曲塊的α-淀粉酶活力呈現(xiàn)出較為緩慢的降低變化,至成熟三個(gè)月時(shí)期后,酶活力基本保持著550 U左右較為平穩(wěn)的狀況(P9～P10)。

曲心樣品中最高酶活力出現(xiàn)在大曲成熟階段(X7～X10),為成熟一個(gè)月大曲樣品(X7)912.09 U,較初始樣品酶活力提高了863.56%,且曲塊發(fā)酵和成熟階段曲心α-淀粉酶活力變化差異較大(p<0.05)。發(fā)酵階段,曲心樣品α-淀粉酶活力表現(xiàn)出迅速升高與較緩回落的變化情況,峰值為曲心大火期X4樣品。而進(jìn)入成熟階段后一個(gè)月時(shí),α-淀粉酶活力又再次快速升高,達(dá)到整個(gè)考察期的活力極值(X7),隨后又迅速下降并維持著平穩(wěn)活力狀況直至出庫(kù)使用。分析這個(gè)現(xiàn)象的原因可能為,曲塊培育期間微生物大量生長(zhǎng)繁殖,α-淀粉酶產(chǎn)生菌群產(chǎn)生的酶在細(xì)胞內(nèi),進(jìn)入存貯期后,曲庫(kù)環(huán)境與曲塊內(nèi)的微環(huán)境的差異變化較大,使得原本在細(xì)胞內(nèi)的酶類,由于菌體營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的大量死亡而釋放了出來(lái)[20]。

2.2 大曲單寧酶活力變化情況

單寧酶(E.C.3.1.1.20)是指能水解單寧酸分子中酯縮酚酸鍵而釋放出沒(méi)食子酸、葡萄糖和沒(méi)食子酰基酯的一類水解酶[22]。以沒(méi)食子酸法測(cè)定大曲曲皮和曲心樣品單寧酶活力情況如圖2所示。

圖2 大曲單寧酶活力分析Fig.2 Tannase activities in Daqu

通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中沒(méi)食子酸含量,考察濃香型大曲曲塊在發(fā)酵和成熟階段,單寧酶活力變化結(jié)果(圖2)顯示,所有大曲樣品酶活力變化范圍為5.07～34.18 U。其中,曲皮樣品的酶活力變化幅度是5.24～34.18 U,曲心為5.07～27.89 U。

大曲曲皮樣品中的單寧酶活力在整個(gè)研究階段有兩個(gè)較為快速的上升時(shí)期和一個(gè)較緩慢的下降時(shí)期(圖2A)。P1到P2時(shí)期為第一個(gè)快速上升的階段,單寧酶活力由5.24 U上升到20.20 U,隨后出現(xiàn)小幅波動(dòng)(P2～P4),由大火進(jìn)入后火期時(shí),濃香型大曲的曲皮單寧酶活力再次迅速升高,達(dá)到曲皮樣品中最大酶活力34.18 U(P5)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行和曲塊入庫(kù)的存貯成熟,酶活力又開(kāi)始逐漸下降至三個(gè)月成熟期的最低值6.70 U。根據(jù)圖2B結(jié)果可以得出,由大曲成形開(kāi)始,曲心單寧酶活力呈現(xiàn)出相對(duì)較為平穩(wěn)的增大變化,至后火樣品(X5)酶活力最大,比成形(X1)時(shí)酶活力提高了5.50倍,但比同時(shí)期曲皮樣品(P5)最大單寧酶活力值低了6.29 U。

分析比較曲皮和曲心樣品單寧酶活力變化情況可以發(fā)現(xiàn),曲皮和曲心樣品總單寧酶活力變化趨勢(shì)較為相似,平均單寧酶活力為16.09 U和14.47 U,差異不顯著(p>0.05)。整個(gè)研究階段中,酶活力的動(dòng)態(tài)變化現(xiàn)象,揭示出隨著曲塊發(fā)酵成熟的進(jìn)行,大曲曲皮或曲心微生態(tài)環(huán)境條件的改變,導(dǎo)致產(chǎn)酶微生物類群或產(chǎn)酶優(yōu)勢(shì)微生物種屬發(fā)生變化,以及衰老細(xì)胞的凋亡使原本在細(xì)胞內(nèi)的酶被釋放到大曲物料中的可能機(jī)制。

2.3 大曲木聚糖酶活力變化情況

在白酒釀制過(guò)程中,木聚糖酶能降解原料中的半纖維素,加速其它酶或微生物對(duì)原料的轉(zhuǎn)化利用,從而提高發(fā)酵效率、增加出酒率[23-24]。在整個(gè)研究階段內(nèi),大曲樣品木聚糖酶活力結(jié)果如圖3所示。

圖3 大曲木聚糖酶活力分析Fig.3 Xylanase activities in Daqu

由圖3可知,曲皮與曲心樣品的木聚糖酶活力變化趨勢(shì)具有一定相似性。其中,曲皮樣品的木聚糖酶活力在曲塊的發(fā)酵期間(圖3A),逐級(jí)上升至P6時(shí)期達(dá)到最大值119.72 U,顯著高于其它曲皮樣品酶活力,較大曲成形時(shí)樣品(P1)的酶活力提高了106.05 U。隨著曲塊入庫(kù)成熟時(shí)間的延長(zhǎng),大曲曲皮樣品木聚糖酶活力逐級(jí)下降,在使用時(shí)略有上升,最終酶活力值為99.85 U,較成熟階段的最小值增加了31.61 U,但比養(yǎng)曲時(shí)期的最大活力降低了19.87 U。

曲心樣品中木聚糖酶活力變化情況主要表現(xiàn)出逐級(jí)升高再迅速下降的規(guī)律。曲心樣品木聚糖酶活力范圍為13.67～80.51 U,最高活力也為養(yǎng)曲階段的X6樣品,進(jìn)入曲庫(kù)后的成熟期前期(X7),曲心樣品酶活力并未如曲皮樣品同一時(shí)期(P7)活力值出現(xiàn)下降的情況,而是大致保持著最高酶活力。隨著成熟時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),曲心樣品木聚糖酶活力急速下降,達(dá)到三個(gè)月成熟時(shí)間的最低值(47.09 U),較最高活力降低了41.51%。

2.4 大曲脂肪酶活力變化情況

在白酒制曲和發(fā)酵期間,脂肪酶參與脂肪類物質(zhì)的水解,使白酒發(fā)酵過(guò)程中酵母等微生物能夠較為充分地利用和轉(zhuǎn)化原料,提高出酒率。此外,脂肪酶的酶促作用,還能提高酒體中有機(jī)酸和甘油的含量,對(duì)白酒口感的醇厚、豐滿有較好的提升作用。大曲在整個(gè)發(fā)酵、成熟過(guò)程中脂肪酶活力變化趨勢(shì)顯示(圖4),曲皮、曲心樣品間變化規(guī)律差異明顯,但總體趨勢(shì)上呈現(xiàn)出初期低后期高的變化。曲皮各樣品在整個(gè)考察時(shí)期內(nèi),脂肪酶酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降再上升下降的波浪式動(dòng)態(tài)變化。曲皮樣品脂肪酶活力在曲塊成形時(shí)(P1)只有75.31 U,隨著曲塊發(fā)酵的進(jìn)行,酶活力迅速升高到起火時(shí)期(P3)達(dá)到一個(gè)小峰值(288.64 U);當(dāng)曲塊發(fā)酵進(jìn)入大火期后,酶活力下降了104.05 U(P4),隨后再次迅速升高達(dá)到曲皮樣品的最大酶活力階段(P6),較P1提高了7.29倍。隨著大曲發(fā)酵進(jìn)程的結(jié)束,進(jìn)入成熟期的曲塊脂肪酶活力,處于持續(xù)降低的階段,到曲塊成熟完成時(shí),曲皮樣品脂肪酶活力值僅為231.38 U。

圖4 大曲脂肪酶活力分析Fig.4 Lipase activities in Daqu

與曲皮樣品相比,曲心樣品中脂肪酶活力在大曲發(fā)酵至成熟的整個(gè)過(guò)程中,發(fā)酵階段的酶活力一直處于較為平穩(wěn)的緩慢增長(zhǎng),至入庫(kù)成熟的一個(gè)月時(shí)期達(dá)到極大值597.50 U(X7),比曲皮樣品P6的最大活力高48.42 U。隨著成熟期的延長(zhǎng),至成熟兩個(gè)月(X8)時(shí)曲心樣品脂肪酶活力急劇降低了221.26 U。隨后,酶活力再次開(kāi)始緩慢升高,至曲塊使用時(shí)活力達(dá)到496.33 U,比曲心樣品的最高酶活力降低了16.93%。

3 結(jié)論

大曲是大曲酒生產(chǎn)必不可少的起酵劑,其中功能各異的酶系是大曲酒品質(zhì)和產(chǎn)量保障的重要基礎(chǔ)。在大曲發(fā)酵和成熟過(guò)程中,不同的微生物在曲塊中的競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)和優(yōu)勝劣汰,并隨著微生物生長(zhǎng)和微環(huán)境條件的改變,造成了主要產(chǎn)酶微生物類群或產(chǎn)酶優(yōu)勢(shì)微生物的種屬變化,使四種酶活力出現(xiàn)不同程度波動(dòng)或升降的變化。

本研究主要針對(duì)大曲中α-淀粉酶、單寧酶、木聚糖酶和脂肪酶活力在大曲發(fā)酵、成熟過(guò)程中的變化情況進(jìn)行測(cè)定分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在整個(gè)考察時(shí)間內(nèi):

a.曲皮樣品中α-淀粉酶活力在發(fā)酵初期升高后,基本在523.28～765.78 U范圍內(nèi)波動(dòng),而曲心樣品中該酶活力升降變化幅度大于曲皮樣品。

b.單寧酶活力在曲皮和曲心樣品間變化規(guī)律較為相似,都呈現(xiàn)出先迅速升高,在后火期達(dá)到最大值后再緩慢降低的變化情況。

c.曲皮樣品的木聚糖酶活力變化情況為,持續(xù)上升至養(yǎng)曲階段達(dá)到最大值119.72 U后逐漸下降;而曲心木聚糖酶活力在養(yǎng)曲和成熟初期活力最大。

d.脂肪酶活力變化趨勢(shì),曲皮樣品與曲心樣品之間差異較大,其中曲皮樣品的酶活力是先升高再降低,然后出現(xiàn)再次升高降低的變化規(guī)律;而曲心樣品的脂肪酶活力一直表現(xiàn)出持續(xù)升高至最大值后急劇下降,然后再次緩慢升高的變化情況。

分析曲皮和曲心樣品最大酶活力出現(xiàn)階段,為分離篩選特定功能酶產(chǎn)生菌提供了重要的借鑒,如篩選高產(chǎn)脂肪酶微生物的適宜時(shí)期主要集中在發(fā)酵后期至成熟前期階段。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及課題組同期進(jìn)行的其它酶活力分析、相應(yīng)產(chǎn)酶微生物多樣性、大曲宏基因組分析等方向的研究,不但為特定功能加強(qiáng)型大曲的研制和功能酶制劑的開(kāi)發(fā)提供參考,也將在一定程度上完善大曲微生物與功能酶系的關(guān)系打下基礎(chǔ),各種現(xiàn)象的可能性推測(cè)也為課題組對(duì)大曲的深入研究,提供了借鑒的思路。

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