海洋藻類藻膽蛋白的提取、純化與應用研究進展

于 嬌,胡 曉,楊賢慶,陳勝軍,*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,國家水產品加工技術研發中心, 農業部水產品加工重點實驗室,廣東廣州 510300; 2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

我國海洋藻類資源豐富,海水養殖面積達140千公頃,年產量高達217萬t[1],具有巨大的碳匯潛力[2]和經濟開發價值。迄今,雖然部分海藻已實現工業化培育、養殖和采收,但海洋藻類仍舊作為初級產品進入銷售市場,高新技術利用不足,精深加工產品較少,海洋藻類經濟效益有待提升。藻膽蛋白(phycobiliprotein,PBP),作為一種具有良好生理功能和生物活性的海藻提取物,主要存在于紅藻、藍藻、隱藻和一些甲藻中,可根據光譜特性的差異分為藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)、藻藍蛋白(phyeocyanin,PC)、別藻藍蛋白(allphycocyanin,APC)和藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin,PEC)。其中PE可根據其光譜特性的細微差異分為R-PE、C-PE、B-PE,而PC又可分為R-PC和C-PC[3],簡稱前分別冠以C-、B-、R-,這些字母用于表示不同的吸收光譜特性[4]。PBP因具有良好的生理功能和生物活性而用途廣泛,其良好的熒光特性被廣泛應用于臨床醫學、免疫學和細胞學等應用領域,其光敏特性可作為光敏劑應用于醫療領域,其作為一種純天然、無公害的色素還可應用于食品、化妝品和染料等工業領域,其抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤等生物活性可作為保健成分應用于保健食品和藥品行業領域。

PBP因具有良好的光學特性,其純度一般采用最大可見吸收峰波長處的吸光值與280 nm處的吸光值之比(Aλmax/A280)來表示。為了獲取高純度、高活性的PBP,國內外研究者們集中于破壁方法和分離純化技術做了大量的工作。而PBP產品多是來自于純天然海洋生物提取,工業生產時常遇到來源于產品得率、產品純度和生產成本的挑戰,因此市場上的PBP產品通常價格高昂,這就限制了其加工生產和推廣利用。為了達到高純度、低成本的商品化生產要求,PBP的提取與分離純化主要集中于合理搭配多種技術、縮減操作流程以及規模化生產。本文主要對PBP的分離純化和應用研究予以概述,以期為促進海藻的開發和精深加工提供重要參考。

1 藻膽蛋白的提取

目前,國內外提取PC的原料多為螺旋藻,而PE的提取原料多為龍須菜和紫菜。作為一種優質的胞內蛋白,提取PBP的首要步驟是破碎藻體組織細胞壁。隨著生物技術產業的迅猛發展,新型破壁方法如液氮研磨法、酶法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和多針-板電暈放電技術提取法等被應用到PBP的提取過程中,與傳統破壁方法相比,具有純度高、成本低、穩定性和延展性好等優勢。

1.1 傳統提取方法

傳統提取方法如水溶液提取法、組織破碎法和反復凍融法,存在著產品耗時長、易變性、效率低和能耗高等缺點,不利于PBP的推廣和使用。水溶液提取法耗時長、效率低,不適合規模化生產,而且溶液雜質的殘留可能會影響后期的分離純化。趙麗等[5]采用水溶液提取法破碎紅藻藻體組織細胞壁提取R-PE,提取時長120 h,純度才達到0.38。組織破碎法操作簡單、省時,但機械破碎時間過長易致使蛋白質變性,需做好降溫措施。鄭江等[6]采用組織破碎法破碎紅毛藻組織細胞,10 min后測得上清液中的PE純度為0.30。反復凍融法是通過-20 ℃下冷凍,5 ℃下融解后引起冰粒的形成和鹽濃度的增加破碎藻體細胞,促進蛋白的溶出以實現PBP的提取富集。反復凍融法雖操作簡單,但其耗時長,能耗高,應用成本較高,只適合實驗室小規模生產。鄭蔚然[7]等采用反復凍融法提取R-PE,凍融6次,每次凍融3 h,R-PE的純度為0.42。

1.2 新型提取方法

1.2.1 液氮研磨法 液氮的溫度為-196 ℃,它不僅能使藻體組織的硬度、脆性增加,易于研磨,還能保護組織成分不被破壞和降解。通常,先用液氮處理藻體使組織細胞被完全凍結,再將組織研磨成粉,置于緩沖溶液中解凍,最后高速離心濃縮粗提液[8]。Soni等[8]采用液氮冷凍藻體,研磨至粉末狀,再置于Tris-HCl緩沖液中解凍,提取的C-PC純度達0.42。與傳統破壁方法相比,液氮研磨法不僅能夠有效維持蛋白質的活性,還具有操作簡單、成本低、重復性和延展性好的優勢[9],可用于規模化破碎藻體組織細胞。丙瀟瀟等[10]向瓷研缽中的紅藻壇紫菜粉加入液氮,反復研磨15 min,并溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中,離心后測得粗提液中的R-PE的純度為0.38。

1.2.2 酶輔助提取法 海藻細胞壁的主要成分是具有多糖類結構的纖維素,可利用纖維素酶或果膠酶水解海藻細胞壁,減少了細胞壁和細胞間質的傳質阻力,有利于PBP高效的流出。趙麗等[5]用纖維素酶提取的R-PE,處理時長15 h,純度可達0.37。與傳統的堿提法相比,酶法反應條件溫和,而且不易引入雜質,且能更好的維持蛋白質的構型、構象和光學特性。施瑛等[11]比較了纖維素酶、果膠酶對紫菜PE的提取效果,研究發現纖維素酶和果膠酶的最佳酶配比為7∶3的復合酶液提取效果更好,得率可達2.26%,純度可達1.66。復合酶比單一酶在藻體組織細胞壁降解效果上更有優勢,為PBP的規模化生產提供了新思路。

1.2.3 超聲波輔助提取法 該法是利用超聲波產生的空穴、熱和機械效應破碎藻體組織細胞壁,促使細胞內的PBP充分溶解出來。超聲波輔助提取法一般不單獨使用,僅作為細胞破壁的輔助手段,通常與水溶液提取法聯合使用。丙瀟瀟等[10]采用超聲波法破碎法提取紅藻中的R-PE,處理時長20 min,其純度可達0.51。與傳統方法相比,超聲波輔助提取法引入的雜質少,耗時短,效率高,但超聲過程中會產生較多熱量,因此需要及時降溫,以免藻膽蛋白變性。Benavides等[12]采用超聲輔助提取紫球藻中的B-PE,研究發現其提取率是水提法的5倍。為了獲得理想的溶解促進和傳質強化的效果,少數研究者采用交替雙頻逆流超聲技術提取蛋白質。交替雙頻逆流超聲技術綜合了交替雙頻超聲技術與逆流提取技術的優勢,既有交替雙頻超聲模式的促溶效果好、節能環保的優點,又有逆流超聲技術提取效率高、能量均一的好處。曲文娟等[13]采用交替雙頻逆流超聲輔助提取條斑紫菜蛋白質,獲得的蛋白得率為24.35%,明顯高于傳統提取方法的蛋白得率7.19%。交替雙頻逆流超聲輔助提取方法較水溶液提取法在生產成本上具有顯著的技術優勢和推廣價值。

1.2.4 微波輔助提取法 微波輔助提取(microwave-assisted extraction,MAE)是一種新型的蛋白質提取技術,比常規提取方法在純度和提取時間上具有顯著的技術優勢[14]。為了防止處理時間過長或溫度過高導致蛋白質失活,需要控制好處理暴露持續時間和處理溫度。Juin[15]首次采用微波輔助提取紫球藻中的PE,研究發現40 ℃時PE具有熱穩定性,并于微波照射10 s后獲得PE的純度最高可達2.2。考慮到產品純度、延展性和生產成本,微波輔助提取法是一種非常高效的提取方法。

1.2.5 多針-板電暈放電提取法 多針-板電暈放電提取法是一種新型的藻體組織細胞壁破壁提取方法,通過多余的負離子與正離子中和放出的巨大的能量使得藻體細胞壁產生0.4～40 μm大小不等的空洞,從而使藻膽蛋白從空洞溶出,并且等離子體溫度較低,不會導致熱量過高引起蛋白質變性。與常規提取方法相比,具有操作簡單、效率高、耗時短、成本低、環保無污染的技術優勢,多針-板電暈放電提取法是一種非常高效的提取方法。趙麗等[5]采用多針-板電暈放電提取紅藻中的R-PE,并通過與溶脹法、反復凍融法和CaCl2破碎法相比較,研究發現僅用3 min就能夠達到最好的破碎效果,獲得的R-PE純度可達0.47,而且整個過程不需要添加任何化學試劑,不需要提取預冷,可在室溫下處理。以PE為例,根據以上文獻總結不同提取方法的優缺點,見表1。

表1 PE的不同提取方法的優缺點Table 1 Advantages and disadvantages of different extraction methods of phycoerythrin

1.3 聯合法

新型提取方法還可與傳統提取方法組合使用,優勢互補,進而實現高提取率粗提液的規模化生產。目前,常見的組合方式有酶法與水溶液提取法、超聲波輔助提取法與反復凍融法等。段杉等[16]研究發現纖維素酶結合水溶液提取法比水溶液提取法在蛋白質提取率上具有更大的優勢。白露等[17]采用超聲波輔助提取法與反復凍融法結合提取壇紫菜蛋白質,表明組合法比單一法在提取得率和含量上效果更優。

2 藻膽蛋白的分離純化

粗提液中PBP純度低、雜質多,需要分離和純化以除去雜蛋白、多糖和其他成分,從而提高PBP純度。國際上PBP產品的純度可劃分為四種級別:食品級(Aλmax/A280>0.7)、藥品級(Aλmax/A280>3.0)、反應級(Aλmax/A280>3.9)和試劑級(Aλmax/A280>4.0)。蛋白質純化的關鍵是根據實驗目的選擇合適的純化技術,并可多種純化技術組合使用,以縮減操作流程、提高純度和降低成本。新型分離純化方法有利凡諾沉淀法、殼聚糖吸附沉淀法、活性碳吸附沉淀法和雙水相萃取法等。

2.1 傳統的分離純化方法

隨著人們對PBP的研究逐漸深入以及各種分離純化技術的不斷出現,對于其分離提純的方法也越來越多。PBP的傳統分離純化方法主要有凝膠層析法、離子交換層析法、羥基磷灰石柱層析法、等電點沉淀法、鹽析法和超濾法。凝膠層析是最簡單和最溫和的層析技術,可用于藻膽蛋白的脫鹽、分離提純和濃縮,但其生產規模小,成本較高。Reisf等[18]利用Sephacryl S-100 HR凝膠純化PE,使其純度從0.8提高到3.5。而離子交換層析是最常用的層析方法,具有純化效果好,分析速度快等優點,但其離子交換層析介質成本較高,這就限制了其工業推廣使用。馮亞非等[19]采用一步羥基磷灰石柱層析法,利用磷酸緩沖液梯度洗脫,后經冷凍干燥,得到藥品級標準的PE。等電點沉淀法應用于工業化生產時,不僅易于擴展,也不需要復雜的操作步驟。目前,常用的等電點沉淀介質是冰醋酸,Zhu等[20]采用冰醋酸作為等電點沉淀介質沉淀PBP,冰醋酸溶液易揮發分離,簡化了生產工藝。硫酸銨沉淀法是最常用的蛋白質沉淀方法,操作簡便,但其最大缺點是耗時長、蛋白質易變性。Sorensen等[21]采用一步、二步硫酸銨沉淀提取C-PC,C-PC的純度提高到0.7和1.1。超濾是一種膜分離技術,不僅能凈化粗提液,濃縮PBP,還可維持其結構特性和光學特性,具有耗時短、產量高和純度高的優點。

2.2 新型的分離純化方法

2.2.1 利凡諾沉淀法 利凡諾沉淀法是一種用于蛋白質的分離純化的新型簡化方法,通過與蛋白質形成復合物使得蛋白質與其他粗提物分離開來。利凡諾試劑可用于沉淀和消除藻類多糖等雜質,還可使用硫酸銨沉淀使目標蛋白與雜蛋白差異分離,可獲得較高純度的目標蛋白[22]。與傳統層析法相比,該法避免了透析步驟,簡化了分離純化步驟,具有簡便、成本低和可擴展性等優點。但試劑的介入帶入了雜質,可通過進一步的凝膠過濾結合除去雜質。Minkova等[23]采用利凡諾試劑對細胞提取液四步沉淀處理,上清液中C-PC純度增加至3.9。這種技術為PBP的分離純化提供了新思路,但該技術仍需發展成熟才能投入到工業化生產中去。

2.2.2 殼聚糖和活性炭吸附沉淀法 殼聚糖對帶負電荷的蛋白質具有吸附沉淀的作用,因而可通過調節pH使得雜蛋白被吸附沉淀,從而實現目的蛋白的分離純化。殼聚糖吸附沉淀法不僅能避免繁雜的層析純化步驟,還具有效率高、成本低、產量高和延展性好的優勢[3]。而活性炭是一種低成本且接觸面積大的疏水性吸附劑,對疏水性蛋白質具有吸附沉淀的作用,通過吸附雜蛋白并使之沉淀實現藻膽蛋白的分離純化。廖曉霞等[24]研究發現殼聚糖和活性炭結合使用可使PC純度由0.93提高至2.78,與傳統的鹽析法相比,殼聚糖和活性炭結合使用具有耗時短、得率高、條件溫和、縮減操作流程等優勢。Gantar等[25]采用活性炭和殼聚糖純化C-PC,研究發現其純度由2.0增加到3.6。

2.2.3 雙水相萃取法 與傳統層析法相比較,雙水相萃取法具有低溶劑、傳質和分相效率高、安全環保等優勢[26]。雙水相萃取法通常作為初步使用,同時也需要與超濾、層析技術相結合使用,提升純度并除去雙水相萃取中的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和小分子雜質。但目前PEG的去除仍有難度,PEG的分子量越大,空間阻力就越大,雙水相體系粘度增加直接加大了分相的難度。Sorensen等[21]采用雙水相萃取法純化提取C-PC,并采用超濾法進一步純化,研究發現C-PC的產量高達42%,純度高達4.5。雙水相萃取法不僅可單次使用,還可多次雙水相萃取以制備高純度的藻膽蛋白。Patil等[27]利用雙水相萃取法分離純化從螺旋藻中提取的C-PC,在單次萃取中C-PC的純度分別為3.23,多次萃取后C-PC的純度提高到4.02。目前,聚乙二醇(PEG)/葡聚糖/水是比較常用的雙水相成分,但由于聚合物的價格昂貴,難以應用到PBP規模化生產中去。因此,有待研究開發新型的相成分以促進萃取法在藻膽蛋白工業化生產中的應用。

3 藻膽蛋白的應用

3.1 天然色素

由于人工合成色素的毒性作用,人們對天然色素的需求越來越大[28],因此PBP作為天然、安全的天然色素添加劑備受食品加工業青睞[29],但其因容易受pH、溫度、光照、礦質元素[30]等因素的影響而在應用上有所限制。蔣保季等[31]對天然食用色素PBP進行了大、小鼠經口LD50,骨髓微核實驗,睪丸精母細胞染色體畸變分析,Ames實驗以及離乳大鼠30 d喂養測定分析,發現PBP對實驗動物無明顯毒性作用,具有廣泛的發展前景。作為一種天然色素,PBP既可取代人工合成的色素[32],還可人為調配PE、PC和APC的比例達到人工染料所不能達到的效果,當其純度大于0.7(食品級)時,可應用于食品、化妝品和染料等工業領域。在歐美、日本等國,PBP廣泛用作食品和化妝品的天然色素,并被制成康復藥品和保健食品。Santos等[33]利用螺旋藻提取PC,并作為食品中的天然色素應用于口香糖、乳制品產品和果凍中。

3.2 保健食品和醫藥

現代研究表明,PBP有免疫調節、抗腫瘤等多種生物學功能[34],能提高人體免疫力、促進血紅細胞生成、抑制癌細胞,從而在醫藥等行業領域有著非常廣闊的應用前景,當其純度大于3.0(藥品級)可應用于保健食品和醫藥領域。葉翠芳等[35]研究發現PBP、多糖、類菌胞素氨基酸等紫菜提取物對紫外輻射損傷有修復作用;PR等[36]研究發現C-PC對腦缺血損傷有明顯的保護作用,從而改善運動功能;Soni等[37]研究發現C-PE能夠劑量反應性地降低CCl4誘發的毒性;Soni等[38]又發現了C-PE對糖尿病并發癥具有修護作用。此外,PBP還具有抗氧化、抗輻射和抗炎癥等功能,能有效的修復氧化損傷和輻射損傷,因此在保健食品行業具有良好的應用前景。Gupta等[39]研究發現C-PC能夠有效地修復TBT誘導的氧化損傷;Patel[40]等發現PC具有良好的羥基和過氧基清除能力;Benedetti等[41]研究發現微藻中的PC具有抗炎癥和抗氧化的功能。

3.3 熒光探針

PBP是一類新型的熒光探針,與傳統化學熒光探針相比,具有靈敏度高、保存期長、無毒副作用、易交聯、選擇性和穩定性好等優勢,當其純度大于4.0(試劑級)時可應用于臨床醫學、免疫學和細胞學等應用領域。PBP中可用于熒光探針的有PE、PC和PEC。PE熒光特性穩定且量子產率高,是最為常用的熒光探針,而PEC因在藻體的含量極低,研究較少。

3.4 光敏劑

光敏劑于特定波長的激光照射下形成激發態,而激發態的光敏劑通過能量傳遞形成單態氧,然后通過相鄰的生物大分子的氧化反應殺死腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤的目的。傳統的光敏劑血卟啉在紫外波段吸收較強,而在太陽光波段吸收也容易引起較強的光敏反應,這就要求患者光敏治療后需要避光數周,盡可能降低毒性反應[42]。PBP克服了傳統光敏劑血卟啉易引發強烈的皮膚光敏毒性的弱點,在其峰吸收波長的激光輻照下引發很強的光敏反應,而在太陽光的照射下則吸收較弱,相應的光敏反應也較弱,對皮膚光敏毒性小,當其純度大于3.0(藥品級)時,可應用于到醫學治療領域,為光敏劑治療腫瘤開啟了新的思路。目前,已有諸多學者正在做PE、PC和APC作為光敏劑的研究。蔡春爾等[43]用大于120 μg·mL-1的PE介導的激光作用下處理人肝癌BEL-7402細胞,研究發現細胞存活率不到30%。李冠武等[42]研究發現Photofrin Ⅱ、PE、PC和APC在太陽光照射下的細胞存活率分別為39%、62%、86%、91%,PE、PC和APC的光敏毒性依次降低,并且均較傳統血卟啉光敏劑的日光光敏毒性弱,可用于開發成新型光敏藥物。

4 展望

PBP的生物活性和生理功能使其在工業、輕工業和醫療行業表現出廣泛的應用前景。隨著生物技術的持續發展,PBP的提取與純化的新型工藝已成為了研究的熱點和焦點。國內外學者基于高收益、高效以及安全環保的規模化生產做了大量的研究工作,新型方法與傳統方法相比較具有低成本、效率高、擴展性好的優勢,但其通常也具有產品易變性等缺點。如何將新型方法與傳統方法相聯合,取其利,避其弊,研究出最適合商品化生產的高純度PBP的提取純化工藝是當下要解決的關鍵技術問題。

迄今,諸多學者針對于PBP的生物活性做了大量工作,并通過體外實驗證明其具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等多種生物功能。隨著技術的飛速發展和人們保健意識的提升,PBP的制備工藝會更加成熟,應用前景將更加廣泛,將促進其在工業、輕工業和醫療行業領域的開發和利用。

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