海菖蒲浸提液對錐狀斯氏藻的抑制效應研究

肖晗, 王璐畇, 趙旻, 陳琪, 段舜山

暨南大學水生生物研究中心, 水體富營養化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室, 廣州 510632

1 前言

赤潮(Harmful Algal Blooms, HABs)是國際社會共同關注和急需研究解決的海洋環境問題之一, 探索經濟有效的防治方法對于保護海洋環境質量、保障養殖業持續發展以及維護人類健康均具有重要意義[1]。錐狀斯氏藻隸屬甲藻門(Pyrrophyta)斯氏藻屬(Scrippsiella Baleth & Loeblich),細胞長為 18—30μ m, 是一種世界廣布性赤潮藻類,其赤潮在世界各地海域時有發生,在我國東南沿海廣泛分布,同時也是我國南海重要的赤潮生物[2]。2000年起我國南海海域接連發生多起大規模錐狀斯氏藻赤潮[3-5], 錐狀斯氏藻赤潮已經成為我國主要的有害赤潮之一。錐狀斯氏藻在遇到不良環境時形成孢囊, 當遇到合適生長條件就會重新萌發并爆發赤潮[3]。錐狀斯氏藻雖然無毒, 但是能夠通過大量的聚集, 造成水體缺氧, 從而導致水生動物的機械性窒息死亡, 進而造成了水質的惡化, 危及到海洋生態系統的安全[6]。赤潮爆發嚴重影響海洋生態系統的結構和功能, 并給漁業造成巨大的損失[7]。

目前國內外尚未找到合理有效的治理方法, 均以預防為主, 治理為輔的策略。目前治理赤潮的方法主要有三種, 分別是物理法[8,9]、化學法[10-13]、生物法[14]。然而, 物理方法成本高、效率低, 化學方法容易產生二次污染[15], 真正可用于實際的方法并不多。化感作用原理的發現為赤潮的防治提供了新的研究思路。高等植物能產生各種次級代謝產物通過根、枝葉、凋落物釋放到環境中[16],來影響周圍其他植物的生長, 從而為自身競爭到更多的光照、水分和礦物質[17]。大型沉水植物為優勢種的水生態系統中通常具有更高的生物多樣性和更清澈的水質, 在浮游植物為優勢種的水生態系統中往往具有低的生物多樣性和糟糕的水質[18]。目前, 利用化感作用控制水華已經成為一個新的研究熱點[16,19]。有研究發現某些大型水生植物如金魚藻[20]、黑藻[20]、水浮蓮[21]、眼子菜[22]、石莼[23]、紅毛藻[24]、狐尾藻[19]對某些藻類具有抑制作用。但是, 關于利用化感作用控制海洋赤潮藻的研究還較少, 亦少見關于海草對赤潮藻生長抑制作用的報道。

海草床生態系統是典型海洋生態系統[25]。除了北冰洋沿岸,全世界幾乎所有的海岸都有海草分布[26]。海草草甸是生產力最高的海洋生態系統之一[27], 一些海草植物能夠產生化感物質, 對其他植物產生抑制效應。例如, 曾經大量生長過波喜蕩(Posidonia oceanica)的海區人工移植其他海草種很難成活, 而重新移植波喜蕩, 建植的成功率最高達到 98%。Harrison[28]利用 14C示蹤法發現大葉藻(Zostera marina)葉片水提物降低了其附生硅藻的光合作用效率。然而, 尚不清楚海菖蒲浸提物是否能夠抑制赤潮藻的生長。為此, 本文研究了海菖蒲干粉三種提取物對典型赤潮藻錐狀斯氏藻生長的影響, 以期為進一步利用海草植物資源提高近海水域的環境生態效益提供新的思路和科學依據。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 赤潮藻

實驗所用藻種錐狀斯氏藻(S. trochoidea)由暨南大學水生生物研究中心藻種室提供。赤潮藻采用改進過的 f/2培養基[29]靜置培養。光照強度為100 μmol·m2·s-1, 光暗比 12L：12D, 培養溫度為(23±1) ℃,鹽度為30, 起始pH為8.0±0.02。每天搖晃赤潮藻三次防止其貼壁生長。藻細胞密度用C6流式細胞儀測定(BD AccuriC6, USA)。在實驗前三天將對數期藻細胞接種到高溫滅菌的培養基中以適應生長環境。

2.1.2 海草植物

海菖蒲(Enhalus acodoides)采集于中國海南省陵水縣新村灣(E109°59'34, N18°23'59)。

2.2 方法

2.2.1 海菖蒲干粉的制備

新鮮海菖蒲葉片采集出水后迅速用蒸餾水和毛刷刷去其表面附著的藻類與其他生物, 然后放入烘箱中 60 ℃烘干至恒重。烘干后的海草用研缽研磨成粉末, 過100目篩網, 4 ℃保存待用。

2.2.2 海菖蒲干粉浸提液母液制備

用電子天平準確稱取40 g海草植物干粉, 加入容量為3000 mL且經過高溫蒸汽滅菌過的玻璃燒杯中, 加入2000 mL人工海水。用無菌封口膜包扎瓶口放入恒溫水浴電磁攪拌鍋中, 調制中等轉速, 25 ℃浸提48 h。浸提液離心(5000 rpm, 15 min), 取上清液。上清液由Millipore水系0.22 μm濾膜過濾去除微生物,得到實驗用浸提母液, 濃度為20 g·L-1。提取液4 ℃保存待用。過濾過程在超凈工作臺中嚴格無菌進行。

2.2.3 海菖蒲乙醇與正己烷粗提物制備

用電子天平分別準確稱取 10 g海草植物干粉,分別加入兩個容量為 500 mL經過高溫蒸汽滅菌過的玻璃錐形瓶中, 分別加入 300 mL乙醇正己烷浸漬提取(10d, 室溫23 ℃)。將浸提液經Millipore有機相0.22 μm 濾紙過濾, 濾液經旋轉蒸發儀減壓旋干(35℃), 濃縮至1—2 mL。將濃縮液用氮氣吹干, 分別得到乙醇提取物與正己烷粗提物。

2.2.4 海菖蒲干粉水體物對錐狀斯氏藻生長的抑制實驗

蒸汽滅菌過的500 mL三角玻璃瓶裝200 mL培養液。錐狀斯氏藻培養體系中海菖蒲水提液濃度設置為0、0.1、0.5、1和2.5 g·L-1, 每個濃度作三組平行。空白對照組中不添加海菖蒲提取液, 加相同體積的滅菌人工海水。錐狀斯氏藻起始培養濃度分別為1×103cells·mL-1, 培養時間為8天。從接種開始每隔24小時取樣2 mL藻液用1%甲醛固定之后用流式細胞儀檢測細胞密度并計算抑制率。

赤潮藻抑制率計算公式如下[30]

其中IR為相對抑制率;N為浸提物處理組的藻密度(cells·mL-1);N0為空白對照組藻密度(cells·mL-1)。

2.2.5 海菖蒲乙醇粗提物與正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長的抑制實驗

海菖蒲乙醇粗提物與正己烷粗提物對錐狀斯氏藻抑制實驗采用無菌 48孔板培養, 培養體系為 2 mL, 將海草粗提物用 2.5‰DMSO 復溶, 粗提物濃度設置為 0、6.25、12.5、25和 50 mg·L-1。每個濃度作三組平行。空白對照組中不添加海菖蒲粗提物,加相同體積的滅菌人工海水和對應濃度的DMSO。錐狀斯氏藻起始培養濃度為1×103cells·mL-1培養時間為12天。從接種開始每隔48小時取樣100 μL藻液用 1%甲醛固定之后用流式細胞儀檢測細胞密度并計算抑制率。

2.2.6 二甲基亞砜作為助溶劑對錐狀斯氏藻生長的影響

用二甲基亞砜作為助溶劑, 分別用不同體積分數的DMSO對五種赤潮藻進行劑量效應測試, 設置空白、0.50%、1%、1.50%、2%、2.50%、3%、3.50%、4%、4.50%(v/v)共計10個濃度梯度, 每24 h測定一次藻細胞在680 nm波長處的吸光值(多孔板法), 通過統計學軟件計算出無可觀察效應劑量(No observed effect level, NOEL)。

2.2.7 統計分析

使用FlowJo軟件完成流式細胞儀數據分析。使用GraphPad Prism 7和Microsoft Excel 2016軟件完成數據統計分析。通過單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗處理組與對照組之間的差異顯著性,當P＜0.05時, 表示差異顯著,P＜0.01時, 表示差異極顯著。

3 結果與分析

3.1 海菖蒲干粉水提液對錐狀斯氏藻生長的抑制效能

圖1-a為不同濃度海菖蒲水提液對錐狀斯氏藻生長抑制曲線。海菖蒲水提液對錐狀斯氏藻生長的影響呈現出明顯的劑量-效應關系。相比空白對照組,0.1 g·L-1處理組在第四天開始對錐狀斯氏藻有抑制作用。0.5、1和2.5 g·L-1處理組藻密度均顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖1 海菖蒲干粉水提液對錐狀斯氏藻生長的影響(a.藻密度;b.抑制率; 平均值±標準誤差,n=3)Fig 1 Effects of Enhalus acoroides dry powder water extracts on the growth of S. trochoidea (a. algal density; b.IR; mean±SD, n=3)

圖1-b為不同濃度海菖蒲水提液對錐狀斯氏藻的生長抑制率曲線。抑制率隨著培養時間的延長而升高, 隨著海菖蒲水提液濃度升高而升高。2.5 g·L-1處理組在第8天達到最高抑制率95.34%。1 g·L-1和2.5 g·L-1處理組在培養的第一天的抑制率分別為43.36%和 48.08%, 0.5、1、2.5 g·L-1處理組均有顯著抑制作用(P＜0.05)。8 天內, 0.1、0.5、1 和 2.5 g·L-1處理組最高抑制率為分別為42.2%、82.47%、95.07%和95.34%。

3.2 海菖蒲乙醇粗提物對錐狀斯氏藻生長的抑制效能

圖2-a為不同濃度海菖蒲乙醇粗提物對錐狀斯氏藻生長抑制曲線。相比空白對照組, 6.25 mg·L-1處理組對錐狀斯氏藻無顯著抑制作用(P＞0.05)。12.5、25和 50 mg·L-1處理組藻密度均顯著低于對照組(P＜0.05)。抑制效果隨海菖蒲濃水提液度升高而升高。

圖2 海菖蒲干粉乙醇粗提物對錐狀斯氏藻生長的影響(a.藻密度; b.抑制率; 平均值±標準誤差, n=3)Fig 2 Effects of Enhalus acoroides ethanol phase extracts on the growth of S. trochoidea (a. algal density; b. IR;mean±SD, n=3)

圖2-b為不同濃度海菖蒲乙醇粗提物對錐狀斯氏藻的生長抑制率曲線。抑制率隨著培養時間的延長而升高, 隨著海菖蒲水提液濃度升高而升高。12.5 mg·L-1處理組在第 12天達到最高抑制率78.55%。12.5、25和50 mg·L-1處理組在培養的第一天的抑制率分別為 20.97%、32.26%和29.84%。12天內, 6.25、12.5、25 和 50 mg·L-1處理組最高抑制率為分別為6.92%、78.55%、56.4%和75.09%。

3.3 海菖蒲干粉正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長的抑制效能

圖3-a為不同濃度海菖蒲正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長抑制曲線。相比空白對照組, 6.25 mg·L-1與12.5 mg·L-1處理組顯著促進了錐狀斯氏藻的生長(P＜0.05)。25 mg·L-1和 50 mg·L-1處理組藻密度均顯著低于對照組(P＜0.05)。抑制效果隨海菖蒲濃正己烷粗提物濃度度升高而增強。

圖3 海菖蒲干粉正己烷粗提物對錐狀斯氏藻生長的影響(a.藻密度; b.抑制率; 平均值±標準誤差, n=3)Fig 3 Effects of Enhalus acoroides hexane phase extracts on the growth of S. trochoidea (a.algal density; b.IR;mean±SD, n=3)

圖3-b為不同濃度海菖蒲正己烷粗提物對錐狀斯氏藻的生長抑制率曲線。抑制率隨著培養時間的延長而升高, 隨著海菖蒲水提液濃度升高而升高。50 mg·L-1處理組在第12天達到最高抑制率58.28%。25 mg·L-1和 50 mg·L-1處理組在培養的第一天的抑制率分別為27.5%和31.25%。12天內, 6.25、12.5、25和50 mg·L-1處理組最高抑制率為分別為5.29%、12.58%、32.45%和58.28%。

3.4 二甲基亞砜作為助溶劑對錐狀斯氏藻生長的影響

不同體積分數二甲基亞砜對錐狀斯氏藻生長的影響如圖4所示,當二甲基亞砜(DMSO)的體積分數≤2.5‰時,對錐狀斯氏藻的生長影響與對照組相比差異不顯著(P＞0.05),而 DMSO的體積分數≥3‰時,對錐狀斯氏藻的生長表現出顯著的抑制作用(P＜0.05),因此實驗中助溶劑DMSO的體積分數選定為2.5‰。

圖4 二甲基亞砜對錐狀斯氏藻藻密度的影響(均值±標準誤差, n=3)Fig 4 Effects of DMSO on the algal density of S. trochoidea

4 討論

本研究采用歐盟和美國國家環保署藻類生長抑制試驗(Algal Growth Inhibition Test)標準方法, 實驗結果可反映海菖蒲干粉提取物對錐狀斯氏藻生長抑制效應。

海菖蒲干粉水浸液(圖1)在很低的濃度下就能影響錐狀斯氏藻生長, 抑藻效果與濃度正相關, 說明海菖蒲中部分水溶性的物質具有抑制錐狀斯氏藻的能力, Grignon-Dubois的研究也支持了我們的結果,研究發現大葉藻的水提物和甲醇提取物在很低的濃度下就對鏈狀亞歷山大藻產生了強烈抑制作用[31],其中水溶性酚類物質對抑制鏈狀亞歷山大藻生長起到主要的作用。乙醇粗提物(圖2)對錐狀斯氏藻起到了無顯著抑制效應(p＞0.05)和顯著的抑制效應(p＜0.05)兩種結果, 抑制效果與濃度成正相關, Shu-Hua Qi[32]從海菖蒲乙醇提取物中分離出11種物質,其中黃酮和類固醇具有抗海洋細菌的活性。正己烷粗提物(圖3)出現了“低促高抑”的雙重濃度效應, 說明海菖蒲正己烷粗提物中同時存在促進錐狀斯氏藻生長和抑制錐狀斯氏藻生長的物質, “低促高抑”現的存在象表明化感物質在環境中的濃度是決定其起作用的關鍵因素, 孫志偉[33]的研究也支持我們的結果, 研究發現紅樹植物提取物對赤潮藻也有抑制效應, 并出現了“低促高抑”的效應。因此海菖蒲粗提物中可能存在三類物質, 一類是可以促進藻類生長的物質, 一類是可以抑制藻類生長的物質, 一類是對藻類生長不起作用的物質, 最終表現出來的效果是這三類物質共同作用的結果[33]。如果促進藻類生長的物質占優勢, 則表現出促進作用, 如果抑制藻類生長的物質占優勢, 則表現出抑制作用。

研究結果表明海菖蒲三種提取物均對錐狀斯氏藻產生了不同程度的的抑制作用。海菖蒲生長在在近岸沿海潮下帶水域, 并能夠長期穩定生長[34], 具有持續釋放化感物質的潛力。海菖蒲海草床還能為許多物種提供庇護場所, 提高近岸水域生物多樣性[35], 將其作為生物防治赤潮的物種具有成本低, 無二次污染的風險, 具有物理方法和化學方法所不具有的優越性,因此, 海菖蒲具有生物防治錐狀斯氏藻赤潮的潛力,其具有應用于近海水體富營養化的治理和開發新型抑藻劑的潛力。

本研究均使用一次性培養, 而且水提液抑制實驗在較小的三角瓶中進行,有機相粗提物實驗在多孔版中進行。因此, 實驗條件尚不能與自然海區的環境條件相吻合, 可能也會造成一定的瓶效應。研究發現海菖蒲中不同極性提取物抑藻能力不同, 抑藻能力隨極性增強而增強。但是具體是什么物質在起作用目前還不太明確, 有待進一步研究。

[1] 王仁君, 唐學璽, 馮蕾, 等. 鼠尾藻對赤潮異彎藻和中肋骨條藻的抑制作用 [J]. 應用生態學報, 2006, 17(12)：2421-2425.

[2] 王朝暉, 鐘文聰, 廖姿蓉. 敵百蟲對兩種赤潮微藻生長的毒性效應研究 [J]. 海洋科學, 2017, 10： 102-108.

[3] 肖詠之, 齊雨藻, 王朝暉, 等. 大亞灣海域錐狀斯氏藻赤潮及其與孢囊的關系 [J]. 海洋科學, 2001, 25(9)： 50-54.

[4] 張玉宇, 呂頌輝. 大亞灣澳頭水域一次錐狀斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)和海洋卡盾藻(Chattonella marina)赤潮的初步探討[C]//中國赤潮研究與防治學術研討會, 2004.

[5] 常虹, 王博, 姚蜜蜜, 等. 深圳大鵬灣海域錐狀斯氏藻赤潮期間細菌群落結構變化研究 [J]. 現代生物醫學進展,2014, 14(10)： 1801-1807.

[6] MANGANELLI M. Blooms of toxic microorganisms in aquatic environments： marine microalgae and freshwater cyanobacteria. A brief review with a particular focus on the Italian situation[J]. Rendiconti Lincei, 2016, 27(1)：135-143.

[7] FREHI H, COUTE A, MASCARELL G, et al. Harmful and red-tide dinoflagellates in the Annaba bay (Algeria) [J].Comptes Rendus Biologies, 2007, 330(8)： 615-628.

[8] ZHANG G, ZHANG P, WANG B, et al. Ultrasonic frequency effects on the removal of Microcystis aeruginosa [J].Ultrason Sonochem, 2006, 13(5)： 446-450.

[9] ZEESHAN M, PRASAD S M. Differential response of growth, photosynthesis, antioxidant enzymes and lipid peroxidation to UV-B radiation in three cyanobacteria [J].South African Journal of Botany, 2009, 75(3)： 466-474.

[10] 利普泰克. 環境工程師手冊 [M]. 北京： 中國建筑工業出版社, 1985.

[11] 梁想, 尹平河, 趙玲,等. 生物載體除藻劑去除海洋赤潮藻[J]. 中國環境科學, 2001, 21(1)： 15-17.

[12] YU Z M, ZOU J Z, MA X N. Applications of clays to removal of red tide organisms. I. Coagulation of red tide organisms with clays [J]. Chinese Journal of Oceanology &Limnology, 1994, 12(3)： 193-200.

[13] CAO X H, SONG X X, YU Z M. Removal efficiency of red tide organisms by modified clay and its impacts on cultured organisms [J]. Environmental Science, 2004, 25(5)：148-152.

[14] LURLING M, VAN GEEST G, SCHEFFER M. Importance of nutrient competition and allelopathic effects in suppression of the green alga Scenedesmus obliquus by the macrophytes Chara, Elodea and Myriophyllum [J]. Hydro-Biologia, 2006, 556(1)： 209-220.

[15] 高偉. 九種殺藻劑和三種復配殺藻劑對銅綠微囊藻、小球藻和水綿生長的影響[D]. 新鄉： 河南師范大學, 2016.

[16] SUN Zhiwei, TIAN Fei, DUAN Luyang, et al. Allelopathic effects of mangrove plant Bruguiera gymnorrhiza on microalgae [J]. Allelopathy Journal, 2012, 30(2)： 291-298.

[17] SAND-JENSEN K, S?NDERGAARD M. Phytoplankton and epiphyte development and their shading effect on submerged macrophytes in lakes of different nutrient status[J]. Internationale Revue Der Gesamten Hydrobiologie Und Hydrographie, 1981, 66(4)： 529-552.

[18] DECLERCK S A J, BAKKER E S, LITH B V, et al. Effects of nutrient additions and macrophyte composition on invertebrate community assembly and diversity in experimental ponds [J]. Basic & Applied Ecology, 2011,12(5)： 466-475.

[19] LU Z, SHA J, TIAN Y, et al. Polyphenolic allelochemical pyrogallic acid induces caspase-3(like)-dependent programmed cell death in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Algal Research, 2017, 21： 148-155.

[20] WANG H Q, ZHU H J, ZHANG L Y, et al. Identification of antialgal compounds from the aquatic plant Elodea nuttallii[J]. Allelopathy Journal, 2014, 34(2)： 207-213.

[21] MULDERIJ G, MOOIJ W M, VAN DONK E. Allelopathic growth inhibition and colony formation of the green alga Scenedesmus obliquus by the aquatic macrophyte Stratiotes aloides [J]. Aquatic Ecology, 2005, 39(1)： 11-21.

[22] AHLUWALIA A S. Cyanobacterial and Algal Allelopathy[M]//Allelopathy. Springer Berlin Heidelberg, 2013：485-509.

[23] ACCORONI S, PERCOPO I, CERINO F, et al.Allelopathic interactions between the HAB dinoflagellate Ostreopsis cf. ovata and macroalgae [J]. Harmful Algae,2015, 49： 147-155.

[24] TANG Y Z, KANG Y, BERRY D, et al. The ability of the red macroalga, Porphyra purpurea (Rhodophyceae) to inhibit the proliferation of seven common harmful microalgae [J]. Journal of Applied Phycology, 2015, 27(1)：531-544.

[25] 楊宗岱. 中國海草的生態學研究[J]. 海洋科學, 1982,6(2)： 34-37.

[26] ROBERTSON A I, MANN K H. Disturbance by ice and life-history adaptations of the seagrass Zostera marina [J].Marine Biology, 1984, 80(2)： 131-141.

[27] RAJA S, THANGARADJOU T, SIVAKUMAR K, et al.Rhizobacterial population density and nitrogen fixation in seagrass community of Gulf of Mannar, India [J]. Journal of Environmental Biology, 2012, 33(6)： 1033-1037.

[28] HARRISON P G, DURANCE C D. Reductions in photosynthetic carbon uptake in epiphytic diatoms by water-soluble extracts of leaves of Zostera marina [J].Marine Biology, 1985, 90(1)： 117-119.

[29] GUILLARD R R L. Culture of Phytoplankton for Feeding Marine Invertebrates[M]// Culture of Marine Invertebrate Animals. Springer US, 1975： 29-60.

[30] 李慶華, 郭沛涌, 田美燕,等. 柳樹葉浸提液對蛋白核小球藻的化感作用[J]. 生態學雜志, 2009, 28(5)：884-888.

[31] LAABIR M, GRIGNON-DUBOIS M, CECCHI P, et al.Allelopathic effects of Zostera spp. on the growth and photosynthetic activity of the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella[C]//Proceedings of the 4th Mediterranean Symposium on Marine Vegetation. Regional Activity Center for Specially Protected Areas,Yasmine-Hammamet, 2010： 187-188.

[32] QI S H, ZHANG S, QIAN P Y, et al. Antifeedant,antibacterial, and antilarval compounds from the South China Sea seagrass Enhalus acoroides [J]. Botanica Marina,2008, 51(5)： 441-447.

[33] 孫志偉, 段璐洋, 周靜韻, 等. 紅樹植物干粉和新鮮組織水提物對兩種赤潮藻的化感抑制效應[J]. 生態科學,2012, 31(2)： 109-114.

[34] YANG D, YANG C. Detection of seagrass distribution changes from 1991 to 2006 in xincun bay, hainan, with satellite remote sensing [J]. Sensors, 2009, 9(2)： 830-844.

[35] LEE S Y, FONG C W, WU R S S. The effects of seagrass(Zostera japonica) canopy structure on associated fauna： a study using artificial seagrass units and sampling of natural beds [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2001, 259(1)： 23-50.