普羅布考對2型糖尿病腎病大鼠足細胞的保護作用

成麗嵐，黃金華，馬愛江，齊 杉，鄭少雄

(1. 河北省直屬機關第二門診部,河北 石家莊 050051；2. 北京市中關村醫院，北京 100080；3. 天津醫科大學第二醫院，天津 300211)

隨著我國人民生活水平的不斷提高，糖尿病的發病率迅猛增長，并呈現年輕化趨勢。糖尿病腎病是糖尿病嚴重并發癥之一，目前對糖尿病引起的終末期腎病尚無特效治療方法。普羅布考是一種調脂及抗氧化應激的藥物，對糖尿病腎病有一定治療作用，但機制不明確。本研究觀察了普羅布考對糖尿病腎病大鼠血脂、氧化應激指標及足細胞相關蛋白Nephrin、podocin、CD2AP表達的影響，旨在探討普羅布考對糖尿病腎病的保護作用機制。

1 實驗資料

1.1實驗動物 雄性SD大鼠36只，平均體質量220 g，購于北大醫學部實驗動物中心，許可證編號：SCXK(京)2007-0001。

1.2主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)、普羅布考(齊魯制藥)、生化指標試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)、糖化血紅蛋白(HbA1c)測定試劑盒及氧化還原指標測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、RT-PCR試劑盒(北京博大泰克生物基因技術有限責任公司)、目的及內參基因引物DNA(大連寶生物工程有限公司合成)及Nephrin單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3分組及模型建立 適應性喂養所選動物3 d后，按照體質量分層隨機原則分為正常組10只、模型組13只和普羅布考組13只，正常組給予普通飼料喂養，模型組和普羅布考組給予高糖高脂飼料喂養。喂養8周后，模型組和普羅布考組以小劑量STZ(15～25 mg/kg)腹腔注射誘導2型糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功)。結果模型組造模成功12只，普羅布考組造模成功11只。之后普羅布考組給予普羅布考500 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予0.5%羥甲基纖維素鈉灌胃，均1次/d，連續8周，期間模型組和普羅布考組給予高糖高脂飼料喂養，正常組普通飼料喂養。從造模成功到實驗結束，正常組存活9只大鼠，模型組和普羅布考組各存活8只大鼠。

1.4動物取材及指標測定 實驗結束后,剪尾取血，用美國強生血糖儀測空腹血糖(FPG)水平；股動脈放血，用荷蘭MERCK公司半自動生化檢測儀測定糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、胰島素水平及氧化應激指標[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)]水平，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FPG×INS/22.5。然后脫頸致死取出雙腎,取一部分腎皮質組織放于甲醛固定液中保存，免疫組化法檢測Nephrin蛋白表達情況；剩余腎皮質組織置于液氮中保存，備做RT-PCR檢測。

1.5Nephrin、podocin和CD2AP mRNA檢測方法采用經典Trizol法提取腎皮質組織總RNA，反轉錄RNA成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。Nephrin、podocin、CD2AP和β-actin的PCR產物長度分別為171,253,454和199 bp。經檢索基因文庫確認引物基因。引物序列：Nephrin上游為5’-GGGGACCCCTCTATGATGAA-3’,下游為5’-GTGAAGCGTCTCACACCAGA-3’;podocin上游為5’-GCAGCCACGGTAGTGAATGT-3’,下游為5’-CAGGAAGCAGATGTCCCAGT-3’;CD2AP上游為5’-TGCTCCTCAAGTCCCACC-3’,下游為5’-CTCCGACGGCTTTATGTT-3’;β-actin上游為5’-TAAAGGGCATCCTGGGCTACAATG-3’,下游為5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3’。反應結束后，取上述PCR產物瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統進行陽性條帶吸光度積分掃描，以β-actin作為內參照，計算mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.13組血脂指標比較 模型組和普羅布考組血清TG、TC、LDL-C水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，HDL-C水平與正常組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；普羅布考組血清TC、LDL-C水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，TG和HDL-C水平均有高于模型組的趨勢，但差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.23組血糖、胰島素和HOMA-IR比較 模型組和普羅布考組FPG、HbA1c、HOMA-IR均明顯高于正常組(P均<0.05)，但模型組和普羅布考組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；3組胰島素水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表1 3組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2 3組大鼠血糖及胰島素比較

注：①與正常組比較，P<0.05。

2.33組血清SOD、GSH-Px及MDA含量比較模型組血清SOD、GSH-Px含量均明顯低于正常組(P均<0.05)，MDA含量明顯高于正常組(P<0.05)；普羅布考組血清SOD、GSH-Px含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，MDA含量明顯低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠血清SOD、GSH-Px及MDA含量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.43組腎組織中Nephrin蛋白表達情況 正常組Nephrin蛋白只在腎小球表達，圍繞腎小球毛細血管襻線狀排列，見圖1；其光密度值0.232±0.018。模型組Nephrin蛋白在腎小球表達紊亂，部分呈顆粒狀分布，見圖2；其光密度值 0.179±0.011，明顯低于正常組(P<0.05)。普羅布考組Nephrin蛋白表達介于正常組和模型組，見圖3；其光密度值0.207±0.112，明顯低于模型組(P<0.05)。

圖1 正常組大鼠腎組織中Nephrin蛋白表達情況(×400)

圖2 模型組大鼠腎組織中Nephrin蛋白表達情況(×400)

圖3 普羅布考組大鼠腎組織中Nephrin蛋白表達情況(×400)

2.53組腎皮質中Nephrin、podocin、CD2AP mRNA表達情況 模型組Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)，普羅布考組Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表4及圖4～6。

表4 3組大鼠腎皮質中Nephrin、podocin、CD2AP mRNA表達情況

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

Marker由下向上為100，250，500，1 000 bp； 1，2，3為β-acttin 199 bp；4，5，6為Nephrin

圖4 3組大鼠腎皮質中Nephrin mRNA表達情況

3 討 論

糖尿病腎病早期臨床表現為蛋白尿，蛋白尿的形成與濾過屏障結構受損有關[1]。腎小球濾過屏障的臟層上皮細胞因其胞體伸出許多偽足，故又稱足細胞。而足細胞是維持腎小球濾過膜結構和功能的主要細胞之一[2]。因為足細胞相互交叉形成濾過裂孔，裂孔由極薄的裂隙膜相連，裂隙膜表面的分子受損，且足細胞的增殖能力弱，不能有效阻擋蛋白等大分子物質的濾過，導致蛋白尿，進而引起并加重腎臟損傷。黃勇等[3]研究發現，嘌呤霉素腎病大鼠蛋白尿的出現與足細胞骨架結構的損傷密切相關。

Marker由下向上為100，250，500，1 000 bp； 1，2，3為β-acttin 199 bp；4，5，6為podocin

圖5 3組大鼠腎皮質中podocin mRNA表達情況

Marker由下向上為100，250，500，1 000 bp； 1，2，3為β-acttin 199 bp；4，5，6為CD2AP

圖6 3組大鼠腎皮質中CD2AP mRNA表達情況

Nephrin是一種跨膜蛋白，是細胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族成員[4]；Nephrin分子在裂隙膜區鄰近的足突之間彼此相互延伸，形成似拉鏈樣多隙濾過結構，這對于維持腎小球濾過膜的完整性起關鍵作用，故有研究提出Nephrin可作為預測腎小球疾病發展的檢測指標[5]。CD2AP屬于免疫球蛋白家族中的跨膜蛋白，可與相關細胞上的CD2受體結合，對維持腎小球濾過膜的超微結構及功能起到了重要作用。CD2AP在腎臟中主要表達于足突細胞[6]。Lv等[7]報道CD2APmRNA表達與24 h尿蛋白定量、腎小球硬化程度呈負相關，可作為評估腎小球病變程度及預后的重要指標。podocin為Stomatin蛋白家族新成員之一，Schwarz等[8]和Lehtonen等[9]的研究均發現CD2AP、Nephrin和podocin三者緊密聯系共同嵌于腎小球裂隙膜中，而裂隙膜的完整性是腎小球濾過機械屏障的關鍵。王詠梅等[10]發現糖尿病腎病大鼠腎組織中Nephrin mRNA表達量明顯低于正常對照組。李秋月等[11]研究發現糖尿病大鼠腎皮質中Nephrin、podocin和CD2AP表達下調。鄧順友等[12]發現糖尿病長期高糖環境下糖基化終末產物及氧化應激反應的作用導致糖尿病大鼠足細胞相關分子 Nephrin、podocin和 CD2AP蛋白表達均下調。本研究結果顯示，糖尿病大鼠腎皮質中Nephrin蛋白和Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對表達量均明顯低于正常大鼠，與上述研究結果一致；且糖尿病大鼠血脂水平高于正常大鼠，抗氧化應激能力明顯低于正常大鼠。推測糖尿病大鼠抗氧化能力減弱，糖脂代謝紊亂，損害了裂隙膜的完整性，使關鍵分子Nephrin、podocin和CD2AP基因和蛋白表達下調，腎小球濾過屏障受損，這可能是糖尿病腎臟損傷、蛋白尿出現的機制。

普羅布考降脂作用明確，其可以降低HDL-C和糖尿病腎病患者的蛋白尿，保護腎功能[13]。本研究結果顯示，普羅布考組血清TC、LDL-C水平和MDA含量均明顯低于模型組，血清SOD、GSH-Px含量及腎組織中Nephrin蛋白和Nephrin、podocin、CD2AP mRNA相對表達量均明顯高于模型組。推測普羅布考可能通過降低血脂水平和提高抗氧化能力，上調足細胞相關蛋白Nephrin、podocin、CD2AP的表達水平改善腎臟超微結構，從而發揮對糖尿病腎病的保護作用。但是普羅布考干預后TG水平升高原因尚不清楚，有待研究。

[參考文獻]

[1] 畢銘鑫，牛玉存，李雪，等. 青稞麥片對空腹血糖受損患者糖脂代謝的影響[J]. 衛生研究，2013，42(5):719-724

[2] Tonolo G,Velussi M,Brocco E,et al. Simvastatin maintains steady patterns of GFR and improves uaer and expression of slit diaphragm proteins in type II diabetes[J]. Kidney Int，2006，70(1):177-178

[3] 黃勇，吳國慶， 竇一田. 腎蘇Ⅳ干預嘌呤霉素腎病大鼠足細胞損傷的機制研究[J]. 陜西中醫，2016，37(11):1559-1562

[4] Ristola M，Lehtonen S. Functions of the podocyte proteins nephrin and Neph3 and the transcriptional regulation of their genes[J]. Clin Sci(Lond),2014，126(5/6):315-328

[5] Ichimura K,Fukuyo Y,Nakamura T,et al. Developmental localization of nephrin in zebrafish and medaka pronephric glomerulus[J]. J Histochem Cytochem,2013,61(4):313-324

[6] Li C,Ruotsalainen V,Tryggvason K,et al. CD2AP is expressed with Nephrin in developing podocytes and is found widely in mature kidney and elsewhere[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2000，279(4):785-792

[7] Lv LL,Cao YH,Pan MM，et al. CD2AP mRNA in urinary exosome as biomarker of kidney disease[J]. Clin Chim Acta,2014，428(2)：26-31

[8] Schwarz K,Simons M,Reiser J. Podocin, a raft-associated component of the glomerular slit diaphragm, interacts with CD2AP and Nephrin[J]. Clin Invest，2001,108(11):1621-1629

[9] Lehtonen S,Zhao F,Lehtonen E. CD2-associated protein directly interacts with the actin cytoskeleton[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2002，283(4):734-743

[10] 王詠梅，楚瑞琦，劉占全，等. 玉米須提取液對糖尿病大鼠腎組織nephrin表達的研究[J]. 中國中醫基礎醫學雜志，2009,15(7)：538-539

[11] 李秋月，李六生，李桂霞，等. 坎地沙坦對糖尿病腎病大鼠足細胞Nephrin、Podocin和CD2AP表達的影響[J]. 華中科技大學學報，2012,41(3)：310-314

[12] 鄧順友，黃賜平，葉穎霞，等. 活血降糖膠囊對糖尿病大鼠足細胞相關分子蛋白表達的影響[J]. 中國醫院藥學雜志，2016，36(14)：1167-1173

[13] Endo K,Miyashita Y,Sasaki H. Probucol delays progression of diabetic nephropathy[J]. Diabetes Res Clin Pract，2006，71(2):156-163