補腎通絡方對膝骨關節炎大鼠氧自由基的影響

楊 帆，侯秀娟，袁 芳，朱躍蘭

(1. 北京中醫藥大學，北京 100029；2. 北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；3. 首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京100010)

膝骨關節炎(KOA)是一種常見的退行性關節病變，具有漸進性破壞的特點，致殘率極高。其主要特點是關節軟骨進行性磨損破壞、關節邊緣及軟骨下骨反應性增生、形成骨贅，同時可伴有不同程度的滑膜炎表現，主要臨床表現是緩慢進展的關節疼痛、壓痛，伴有僵硬、腫大、活動受限，嚴重者會導致關節功能障礙甚至殘疾。其發病可能與遺傳、性別、年齡增長、體質量增加及創傷、炎癥等多種因素有關[1]。氧自由基指標中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化脂質(LPO)的含量可以反映出組織內氧自由基的生成及分解情況，監測這些指標的水平變化可判斷軟骨組織的破壞情況[2-3]。補腎通絡方具有補益肝腎、活血通絡的作用，在臨床上治療膝骨關節炎療效很好。本實驗旨在通過觀察補腎通絡方對膝骨關節炎大鼠血清SOD、MDA和LPO含量的影響，探討該方治療膝骨關節炎的作用機制。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠42只，體質量180～220 g，由斯貝福(北京)生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0002。大鼠飼養于中國中醫科學院醫學實驗中心的清潔級環境中，環境溫度為(26±1)℃，水瓶給水，自由進食，普通飼料喂養。適應性喂養1周后進行實驗。

1.2主要試劑與器材 木瓜蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司提供，25 g/瓶)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司，500 mL/瓶)，SOD、MDA、LPO ELISA試劑盒(北京歐北生物科技有限公司提供)，電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司提供]，Centrifuge 5810R(Eppendorf AG公司提供)。

1.3實驗藥物 美洛昔康片(上海勃林格殷格翰藥業有限公司，國藥準字H20090789，7.5 mg/片)；抗骨增生膠囊(江蘇康緣藥業股份有限公司，國藥準字Z10980006，0.35 g/粒)；補腎通絡方(原藥材每劑含量：骨碎補9 g、桑寄生15 g、川牛膝12 g、雞血藤15 g、白芍12 g、穿山龍15 g、川芎10 g，由北京中醫藥大學東方醫院藥房提供，制成顆粒后每劑藥質量為10 g)。灌胃劑量根據大鼠與人的體表面積比值進行換算[4]。

1.4分組、造模及干預 按照隨機數字表法將42只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥組、中成藥組、補腎通絡方低劑量組、補腎通絡方中劑量組和補腎通絡方高劑量組，每組6只。除正常組大鼠外，其余組大鼠均參照文獻[5]方法造模：于大鼠雙側后肢膝關節腔內注射4 %木瓜蛋白酶溶液0.2 mL/肢，第1，4，7天各1次。大鼠常規飼養，末次注入木瓜蛋白酶溶液后第2天，隨機選2只大鼠對其行雙側膝關節X射線檢查，以確定造模是否成功。確認造模成功后第2天，西藥組給予美洛昔康0.781 mg/kg混懸液灌胃，中成藥組給予抗骨增生膠囊0.547 g/kg混懸液灌胃，補腎通絡方低、中、高劑量組分別予補腎通絡顆粒方0.52，1.04，2.08 g/kg混懸液灌胃(10 g顆粒方相當于88 g原藥材)，正常組及模型組均給予等體積蒸餾水灌胃，均每天1次，連續灌胃4周。

1.5標本采集及檢測 各組大鼠于實驗結束后采用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后，經腹主動脈取血，約8mL/只，室溫下靜置2h后，以3 000 r/min轉速離心15 min，分離留取上層血清，分裝于離心管內，做好標記后置于-80 ℃冰箱保存備用，利用ELISA法按試劑盒提供的操作流程，分別測定血清中SOD、MDA、LPO含量。

2 結 果

2.1大鼠造模前后膝關節X射線表現 造模前脛骨平臺及股骨髁骨面光滑平整，關節間隙大小適中，關節邊緣整齊規則無骨贅，關節內無游離體，軟骨下骨密度分布均勻，見圖1及圖2。造模后脛骨平臺骨面欠光滑，略有不平整，且關節間隙較造模前有所變窄，見圖3及圖4。

2.2各組大鼠血清中SOD、MDA和LPO含量 模型組大鼠血清中MDA和LPO含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，SOD含量低于正常組(P<0.05)。各給藥組大鼠血清中MDA和LPO含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，西藥組和中成藥組SOD含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，補腎通絡方各劑量組SOD含量與模型組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。補腎通絡方中劑量組血清中MDA和LPO含量在3組之間最低，SOD的含量最高，但3組之間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。補腎通絡方高劑量組血清中MDA和LPO含量明顯高于西藥組(P均<0.05)，且LPO含量明顯高于中成藥組(P<0.05)。見表1。

圖1 造模前大鼠右膝關節矢狀位X射線影像

圖2 造模前大鼠左膝關節矢狀位X射線影像

圖3 造模后大鼠右膝關節矢狀位X射線影像

圖4 造模后大鼠左膝關節矢狀位X射線影像

表1 各組大鼠血清SOD、MDA和LPO含量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與補腎通絡方高劑量組比較，P<0.05。

3 討 論

骨關節炎是以關節僵硬、腫痛及活動困難為主要表現的一種常見病，多見于中老年人，是最常見的慢性退行性關節病損，又稱退行性骨關節病、肥大性骨關節病和老年性骨關節病。據統計，60歲以上人群中患病率達50%，75歲以上人群中患病率高達80%，本病致殘率也可達到53%[6]。但當前對于骨關節炎的具體發病機制仍不是十分清楚，臨床上也無治愈本病的明確方法。既往研究發現，關節軟骨由于不同誘因發生磨損導致性狀改變，進而軟骨代謝異常，造成軟骨細胞破壞產生大量氧自由基，各種因素同時作用加重軟骨細胞的損傷、老化等，使關節出現進行性的退行性改變[7-8]。

骨關節炎在中醫中屬于“痹病”“骨痹”的范疇，以肌肉、筋骨、關節發生酸痛，麻木，屈伸不利，甚或關節腫大灼熱等為主要臨床表現。如《靈樞·刺節真邪篇》：“虛邪之中人也，灑淅動形，起毫毛而發腠理，其入深，內搏于骨，則為骨痹。”本病常見于中老年人，系年邁體弱、正氣耗損、氣血不足，若復感外邪，氣郁痰滯血瘀阻于經絡而發病，主要涉及肝、脾、腎三臟[9-10]。《類證治裁·痹證》有云：“諸痹……良由營衛先虛，腠理不密，風寒濕乘虛內襲。正氣為邪阻，不能宣行，因而滯留，氣血凝滯，久而成痹。”表明其病機為正虛邪留，氣血凝澀不通，虛實夾雜，以肝腎虧虛為根本，痰瘀阻絡為標實。因此治療上以補益肝腎為主，配合活血通絡[11]。補腎通絡方是朱躍蘭教授多年治療骨關節炎的經驗方，具有補益肝腎、通經活絡之功效，可明顯改善肝腎虧虛、瘀血阻絡所致的關節疼痛、屈伸不利、行動不便等。近年研究表明，本方具有抑制膝骨關節炎模型大鼠血清中炎性細胞因子、調節膝關節軟骨含水量作用，進而改善疼痛、腫脹、活動受限等癥狀[12-14]。

目前研究表明，軟骨細胞的破壞、衰老與氧自由基的關系極為密切，氧自由基作用于細胞脂膜，攻擊其中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發脂質過氧化反應，產生LPO，而它又正反饋攻擊生物膜和亞細胞器，使細胞膜產生更大的損傷，形成一系列惡性循環；同時誘使進一步產生連鎖增殖反應，最終形成穩定的降解產物MDA[15-16]。由于LPO和MDA都是氧自由基作用后過氧化反應的產物，因此檢測血清中LPO和MDA的含量就可以反映脂質過氧化反應的程度。而SOD是一種活性蛋白酶，能催化氧自由基轉變成為H2O2和O2，是一種重要的氧自由基清除酶，通過清除軟骨損傷產生的氧自由基而保護軟骨，緩解軟骨進一步被破壞的過程[17-18]。因此，SOD的含量變化可以反映治療手段對骨關節炎是否有效。提高SOD含量，降低MDA和LPO含量，能夠減少氧自由基產生，減緩過氧化反應，抑制軟骨破壞，延緩骨關節炎的病程進展[19-20]。

本實驗結果顯示，模型組中MDA和LPO含量明顯高于正常組，SOD含量明顯低于正常組，說明氧自由基參與了骨關節炎的發病。而經補腎通絡方干預后，MDA和LPO含量明顯下降，SOD含量明顯升高，說明本方能夠清除氧自由基；其中補腎通絡方中劑量組各指標改善更明顯，說明該濃度在此次實驗動物的藥物治療監測中為最佳濃度；而補腎通絡方不同劑量組之間差異無統計學意義，可能考慮與實驗動物數量較少有關，有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Conaghan PG,Porcheret M，Kinqsbury SR,et al. Impact and therapy of osteoarthritis:the Arthritis care OA nation 2012 survey[J]. Clin Rheumatol,2015,34(9):1581-1588

[2] Lawrence RC,Felson DT,Helmick CG,et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. Part Ⅱ[J]. Arthritis Rheum，2008,58(1):26-35

[3] Attur M,Millman JS,Dave MN,et al. Glatiramer acetate,the immunomodul atory drug,inhibits inflammatory mediators and collagen degradation in osteoarthritis(OA)cartilage[J]. Osteoarthritis Cartilage,2011,19(9):1158-1164

[4] 徐叔云. 藥理學實驗方法[M]. 北京:人民衛生出版社,2002:203-204

[5] Havdrup T,Telhag H. Papain-induced changes in the knee joints of adult rabbits[J]. Acta Orthop Scand,1977,48(2):143-149

[6] 中華醫學會骨科學分會. 骨關節炎診治指南(2007年版)[J]. 中國醫刊，2007，42(12)：30-32

[7] 李登曉，徐璇，朱潔，等. 滑膜炎膠囊對兔膝骨性關節炎組織病理學及NO、SOD、COMP等的影響[J]. 上海中醫藥雜志，2014,48(4):86-90；101

[8] 許波，徐志斌，洪振強. 陽和湯對兔膝骨關節炎模型關節液中SOD、NO的影響[J]. 風濕病與關節炎，2015,4(9):9-12

[9] 王雷，閆相斌. 膝骨關節炎采用獨活寄生湯輔助效果及對關節滑液中細胞因子的影響[J]. 陜西中醫，2016,37(12):1600-1602

[10] 劉淑剛，王金榜. 現代中醫對膝骨關節炎的認識[J]. 現代中西醫結合雜志，2013,22(13):1473-1475

[11] 李冉，白嵐，李樹祝. 膝關節骨性關節炎中醫治療模式研究進展[J]. 現代中西醫結合雜志，2014,23(1):104-107

[12] 史云暉. 補腎活血方對大鼠膝骨關節炎細胞因子的影響及臨床療效觀察[D]. 北京：北京中醫藥大學，2013:46-49

[13] 李明曦. 從炎性細胞因子與Dickkopf-1變化研究補腎活血方對絕經后膝骨關節炎的干預作用[D]. 北京：北京中醫藥大學，2015:68-70

[14] 李海群. 塞來昔布對大鼠骨關節炎模型關節軟骨中NF-κB表達的影響[J]. 現代中西醫結合雜志，2014,23(19):2072-2074

[15] 朱付平，周鈺龍，李曉軍，等. 桃紅四物液對肢體缺血再灌注損傷大鼠血清SOD和MDA的影響[J]. 中醫藥導報，2015,21(21):17-19

[16] 薛錚，陳亞堃，錢鈞強. 鹽酸氨基葡萄糖對膝骨關節炎患者關節液中SOD和MDA水平的影響[J]. 中國藥師，2012,15(4):540-542

[17] 陳守中，王志文，王國權，等. 抗骨增生片對兔膝骨關節炎滑膜病理形態及SOD、NO表達的影響[J]. 河北聯合大學學報：醫學版，2014,16(2):143-145

[18] 白鷺. 骨痛方對膝骨性關節炎患者NO、SOD、MDA的影響[J]. 河南中醫，2016,36(8):1439-1440

[19] 姚振江，張教明，王傳波，等. 針刀結合手法治療KOA的療效及對血漿氧自由基代謝的影響[J]. 中國康復，2010,25(5):353-355

[20] 趙幸熬，婁玉鈐，張廣輝，等. 健膝丸對大鼠膝骨關節炎SOD、MDA、NO的影響[J]. 風濕病與關節炎，2013,2(9):37-40