同位素標記原兒茶酸-(13COOH)的合成研究

徐建飛，劉占峰，盧偉京，雷 雯，侯 捷，杜曉寧

(上海化工研究院有限公司 國家同位素工程技術研究中心 上海穩定性同位素工程技術研究中心，上海 200062)

原兒茶酸是白色至微棕色針狀結晶，熔點約200 ℃(分解)，溶于熱水、乙醇和乙醚，微溶于冷水，不溶于苯[1]。在沸水中分解，并放出二氧化碳。水溶液遇三氯化鐵呈綠色，遇碳酸氫鈉呈暗紅色[2]。原兒茶酸具有抗菌作用，體外試驗時對綠膿桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、產堿桿菌及枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用，亦有祛痰、平喘作用，臨床用于治療慢性氣管炎[3-4]。原兒茶酸廣泛地應用于醫藥、化工等行業，是重要的醫藥化工中間體，近年來國內外的化工需求量逐漸增加[5-6]。

同位素標記原兒茶酸是醫藥和化工領域重要示蹤劑。同位素示蹤技術是從體外加入與生物體內的元素或物質完全共同運行的示蹤物，用以追蹤生物體內某元素或某物質的運行或變化的一種方法[7]。利用穩定同位素標記技術，對藥物進行同位素標記，通過同位素藥物和代謝物檢測，對其藥理學、毒理學、藥代學和臨床研究提供精準示蹤，為新藥研發提供可靠數據，同時提高我國藥物研發實力，促進人類疾病治療和健康發展[8-9]。“精準醫療”為未來醫藥學指明了方向，不僅是一種定制醫療模式，還將對當代醫藥產業產生全方位的影響，例如個性化用藥、精準藥物設計、健康數據獲取等。目前，穩定性同位素標記示蹤劑已廣泛應用于人類健康的精準醫療領域[10-11]，在醫學領域的臨床研究、多種疾病的診斷與鑒別、病情判斷、治療效果評價、臟器功能研究和新藥開發等方面取得了成功，具有很好的應用價值。

文獻報道的原兒茶酸合成方法有：(1) 香蘭素經堿熔溶氧化脫甲基，再經酸化制備，該工藝需要240 ℃以上高溫，反應大部分時間為固相反應，難以控制，必須使用特殊的反應設備，投資大、設備利用率低，特別是難以進行同位素標記產品的制備[12]；(2) 采用胡椒醛作原料，先用高錳酸鉀氧化制成胡椒酸，再經三氯化鋁水解制備原兒茶酸[13]，此法收率較高，但同樣難以引入同位素標記。參考以上路線，設計了合成路線，可為醫藥和化工領域研究提供重要的示蹤劑。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

7890B-7000C氣質聯用儀：美國安捷倫公司，配有EI離子源及Qualitative Analysis B.06.00色譜工作站；LC-MS 2020液質聯用儀：日本島津公司產品，配有電噴霧離子源(ESI)及LabSolutions系統工作站；Magna-IR-550型紅外光譜儀：美國Nicolet產品，KBr壓片制樣；Bruker AV 400 MHz核磁共振：德國Bruker產品，配有超屏蔽超導磁體系統。

1.2 主要材料與試劑

13C標記13CO2：99.0%13C，美國CIL公司產品；3,4-二甲氧基溴苯：分析純，美國Sigma-Aldrich公司產品；原兒茶酸：標準品，美國AccuStandard公司產品；其余均為市售的國產分析純試劑，溶劑做無水處理。

1.3 合成方法

原兒茶酸-(13COOH)合成路線示于圖1。稱取3.1 g鎂條和30 mL 2-甲基四氫呋喃混合，在N2保護下，同時滴加14.1 g的3,4-二甲氧基溴苯的2-甲基四氫呋喃溶液和12.1 g 1,2-二溴乙烷溶液，80 ℃下加熱回流。升溫時引發反應，30 min后反應液開始劇烈反應，回流4 h后，反應液呈微渾濁狀，鎂條反應完全。

將反應液冷卻至-10 ℃，通入5 L13C標記13CO2氣體，低溫下攪拌反應2 h。反應結束后用1 mol/L H2SO4水解。用100 mL無水乙醚萃取，飽和NaCl洗，無水Na2SO4干燥過夜。旋去溶劑，得7.70 g淡黃色中間體3,4-二甲氧基苯甲酸-(13COOH)，收率65.1%。ESI-MSm/z:181[M-H]-；1H NMR (CD3OD，400 MHz)，δ：3.83(d，6 H，J= 7.8 Hz ，CH3)，6.82 (d，1 H，J= 8.4 Hz，H-5)，7.44 (dd，1 H，J= 8.4，1.6 Hz，H-6)，7.45(d，1 H，J= 1.6 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD)，δ：56.83，115.3,0，116.61，121.74，122.24，144.81，150.01。

圖1 原兒茶酸-(13COOH)合成路線Fig.1 Synthesis of protocatechuic acid-(13COOH)

將100 mL BBr3的二氯甲烷溶液冷卻至-20 ℃，加入7.70 g 3,4-二甲氧基苯甲酸-(13COOH)，保持低溫，攪拌過夜。反應加入少量水進行淬滅，過濾，濾液用無水乙醚萃取3次，飽和NaCl洗，無水Na2SO4干燥過夜。旋去溶劑，得褐色粗品6.15 g。

將粗品直接用熱水溶解(70～80 ℃)，活性炭脫色1 h，過濾后旋去大部分水，冷卻后放置于冰箱過夜析出無色固體，真空干燥后得到4.60 g原兒茶酸-(13COOH)，收率70.1%。熔點200～200.8 ℃[14]。

2 結果與討論

2.1 引發劑對3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響

格利雅反應常用的引發劑可以是碘甲烷、單質碘和1,2-二溴乙烷。在N2保護下，使用四氫呋喃(THF)作溶劑，考察不同引發劑對中間體3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響，結果列于表1。

表1 不同引發劑對3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響Table 1 Effect of different initiators on the yield of 3,4- dimethoxy benzoic acid

由表1 可以看出，單質碘未引發反應，造成反應失??；碘甲烷引發反應較為困難，造成3,4-二甲氧基苯甲酸的收率偏低；1,2-二溴乙烷作為引發劑時可以有較好收率。原因在于1,2-二溴乙烷和金屬鎂表面的氧化物反應生成溴化鎂和乙烯，鎂表面的氧化膜消耗完以后，新鮮的鎂暴露出來，和原料3,4-二甲氧基溴苯反應生成格式試劑。所以在合成中間體3,4-二甲氧基苯甲酸中選擇1,2-二溴乙烷為引發劑。

2.2 溶劑對3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響

不同溶劑對3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響列于表2。在格式反應中，一般使用絕對乙醚、無水四氫呋喃和無水甲基四氫呋喃三種溶劑，三種溶劑均使用鈉絲回流至二苯甲酮顯紫色。以3,4-二甲氧基溴苯為原料制備目標產物3,4-二甲氧基苯甲酸為研究對象，討論不同溶劑對反應收率的影響。

表2 不同溶劑對3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響Table 2 Effect of different solvents on the yield of 3,4-dimethoxy benzoic acid

注：反應時均以回流溫度反應。

格利雅反應通常選用絕對乙醚作溶劑。這是由于乙醚分子中的氧原子具有孤對電子，可以和格氏試劑形成可溶于溶劑的配合物。但是在此反應中，反應生成物因在溶劑中溶解度差而覆蓋在金屬鎂表面，從而使格利雅反應終止。除了絕對乙醚外，四氫呋喃也是進行格利雅反應的良好溶劑，可以順利地發生反應。當使用2-甲基四氫呋喃做溶劑時，也可以順利發生反應，并且反應收率最高。原因在于2-甲基四氫呋喃的沸點(80 ℃)比四氫呋喃的沸點(66 ℃)高，提高反應溫度可以更容易引發反應，因此提高了反應速度；另外格氏試劑在甲基四氫呋喃中的溶解度也較大，而2-甲基四氫呋喃在水中的溶解度比四氫呋喃低，因此可以更容易地將反應產物獨立地包含在其中。經三種常用溶劑比較，2-甲基四氫呋喃優于另外兩種溶劑。

2.3 脫甲基反應

3,4-二甲氧基苯甲酸脫甲基方法較多，嘗試了如下三種方法。

(1) AlCl3法。二氯甲烷作溶劑，室溫反應后能脫除甲基，但是不完全，收率偏低。

(2) HBr法。加入5～10倍量市售48%HBr進行回流反應，但是原兒茶酸在高溫中會分解，造成收率偏低。

(3) BBr3法[15]。二氯甲烷作溶劑，-20 ℃下攪拌過夜，完全脫除甲基，并且避免了因為溫度高而使產品分解，操作簡單，收率高，其反應機理示于圖2。經比較，BBr3法是3,4-二甲氧基苯甲酸脫甲氧基較優方法。

圖2 BBr3脫甲基反應機理Fig.2 Mechanism of demethylation using BBr3

2.4 產物結構表征

2.4.1HPLC 以市售原兒茶酸標樣為外標試劑，通過HPLC的測試分析，證明本實驗合成產物原兒茶酸-(13COOH)與標樣保留時間一致，外標法[16]定量分析其純度為99.1%，結果示于圖3。

2.4.2MS 取配制好的原兒茶酸-(13COOH)甲醇溶液進行LC-MS聯用負離子模式分析，電噴霧離子源測定結果示于圖4。

由圖4可知，m/z154為[M-H]-峰。天然豐度產物分子離子峰為m/z154，經13C標記后分子離子峰為m/z155，在ESI負離子模式下減氫離子的分子離子峰為m/z154，可以確認樣品相對分子質量為m/z155，同理論值。m/z154與m/z153峰強度比較，經質量簇計算方法[17]計算13C同位素豐度98.9%。

2.4.31H NMR 原兒茶酸-(13COOH)：1H NMR (CDCl3，400 MHz)，δ：7.08(d，1 H，J=8.4 Hz，H-5)，7.35(dd，1 H，J=8.4, 1.6 Hz，H-6)，7.48(d，1 H，J=1.6 Hz，H-2)。δH7.08處峰為苯環上5位的氫，峰面積為1，δH7.35處峰為苯環上1位的氫，峰面積為1，δH7.48處峰為苯環上的6位的氫，峰面積為1。羧基和羥基由于在氘代溶劑中易被氘代，故無特征峰，結果示于圖5。各峰歸屬均符合理論值。

a——原兒茶酸;b——原兒茶酸-(13COOH)圖3 原兒茶酸的HPLC圖a——ST of protocatechuic acid; b——Protocatechuic acid-(13COOH)Fig.3 HPLC of protocatechuic acid

圖4 原兒茶酸-(13COOH)ESI質譜圖Fig.4 ESI MS of protocatechuic acid-(13COOH)

圖5 原兒茶酸-(13COOH)1H NMRFig.5 1H NMR of protocatechuic acid-(13COOH)

3 結論

以3,4-二甲氧基溴苯為原料經三步反應合成原兒茶酸-(13COOH)，并用HPLC、MS、1H NMR 和13C NMR對最終產物進行表征，確定了其結構、純度和同位素豐度。該方法制備原兒茶酸-(13COOH)路線簡潔、高效，得到的化合物作為重要示蹤劑為醫藥和化工領域研究提供了基礎。

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