北冰紅山葡萄轉色至冰凍期總酚含量變化規律研究

丁鑫，孟祥敏，賀陽，許志新，初百吉，文連奎

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

北冰紅山葡萄（Vitis amurensis Rupr）是以“左優紅”為母本，“86-24-53”為父本通過雜交而成的山葡萄新品種[1]。北冰紅具有較好的抗寒、抗病特性，所釀冰酒口感滑潤，酒香醇厚，因此成為冰葡萄酒釀造的主要品種[2-4]。

多酚是具有苯環并結合多個羥基化學結構的一類化合物，植物葉片、花瓣和果實的不同顏色都與多酚物質相關[5]，研究表明，多酚類化合物具有降血脂、清除自由基、防止衰老和腫瘤、抗動脈硬化等保健功能[6-9]，對葡萄漿果和葡萄酒的質量有較大影響[10-11]。北冰紅屬于雜交新品種，對其酚類物質變化規律的研究尚未見報道。

目前，測定葡萄中總酚含量的方法大多采用福林-酚比色法[12-15]。由于不同植物的多酚含量與種類不盡相同，因此若用福林-酚比色法測定不同植物中的總酚含量時，需對其條件進行改進。本文采用福林-酚比色法對檢測條件進行優化后，測定北冰紅果實轉色至冰凍期多酚物質的含量，研究其發育過程中總酚含量的變化趨勢，為提高北冰紅冰葡萄酒的酒質提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北冰紅山葡萄：于2016年采于通化市柳河縣葡萄酒研發中心葡萄基地；福林-酚試劑：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（分析純）：北京化工廠；沒食子酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；FA-2004電子天平：上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采摘

自2016年8月17日開始每5天采樣一次，直至9月30日，此后每10天采樣一次，到11月30日結束。每次剪取葡萄果實100粒左右，分裝于保鮮袋中，-18℃保藏。試驗前室溫解凍。

1.3.2 樣品的制備及溶液配制

取解凍后北冰紅去籽，破碎，取破碎后的北冰紅果實（20.00±0.50）g放入250 mL容量瓶中，加入一定量95%甲醇，60 kHz超聲波提取30 min，95%甲醇定容至250 mL，6000 r/min 4℃冷凍離心15 min，取上清液保存備用。

0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液：準確稱?。?.0010±0.0005）g C7H6O5·H2O，蒸餾水定容至100 mL。

1.3.3 碳酸鈉與福林酚試劑用量的確定

碳酸鈉用量的確定：取7份1 mL沒食子酸標準溶液于25 mL的具塞試管中，分別加入1 mL的福林-酚試劑，混勻靜置 30 s 分別加入 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至 25 mL，常溫避光反應2 h，765 nm測量吸光度，確定最大吸光度對應的福林-酚試劑與Na2CO3溶液的體積比。

福林-酚用量的確定：取7份1 mL沒食子酸標準溶液于 25 mL 具塞試管中，分別加入 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s后分別加入 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL 的 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，常溫避光反應2 h后，765 nm測量吸光度，確定福林-酚試劑與反應液的體積比。

1.3.4 最佳反應溫度的確定

取7份1 mL樣品液于25 mL具塞試管中，分別加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至 25 mL，分別在 12、16、20、24、28、32、36 ℃的溫度下避光反應 2 h，765 nm 測量吸光度，確定最佳的反應溫度。

1.3.5 最佳顯色時間的確定

取7份1mL樣品液于25 mL具塞試管中，分別加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，最佳反應溫度下分別避光反應 1、2、3、4、5、6、7 h，765 nm 測量吸光度，確定最佳的顯色時間。

1.3.6 標準曲線的建立

移取 0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL 沒食子酸標準溶液于25 mL具塞試管中，分別加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，20℃避光反應4 h，以0樣為空白，765 nm測量吸光度，以沒食子酸標準溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線。

1.3.7 樣品總多酚含量的測定

移取1 mL樣品液于25 mL具塞試管中，加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，20℃避光反應4 h，根據標準曲線回歸方程計算樣品液中總多酚含量。

1.3.8 分析方法的評價

精密度試驗：取5份相同處理的樣品溶液100 μL于25 mL具塞試管中，按照總酚含量測定的最佳條件，測定吸光度，計算相對偏差，評價精密度。

重復性試驗：取5份20 g同一日期取樣的葡萄果實，參照樣品制備方法，平行制備5份樣品溶液，按照總酚含量測定的最佳條件，測定吸光度，計算平均多酚的含量。

穩定性試驗：取5份同一處理的樣品溶液100 μL于25 mL具塞試管中，按照總酚含量測定的最佳條件，于 20 ℃條件下繼續放置 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 后在765 nm處測定吸光值，計算相對偏差，評價穩定性。

加標回收試驗：取5份同一處理的樣品溶液100 μL于25 mL具塞試管中，分別加入不同體積濃度為 0.1 mg/mL 的沒食子酸標準溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，混勻后加入福林-酚試劑4 mL，混勻靜置30 s后加入12%Na2CO3溶液8 mL，蒸餾水定容至25 mL，于20℃避光反應4 h測量吸光度，計算沒食子酸的回收率，計算相對偏差，評價精密度和可靠性。

2 結果分析

2.1 顯色劑用量的確定

2.1.1 12%Na2CO3用量的確定

福林-酚比色法中Na2CO3溶液是反應體系的緩沖液，Na2CO3溶液用量的多少在很大程度上影響多酚物質的顯色效果，用量不足則使多酚物質顯色不完全，吸光度偏低。12%Na2CO3對顯色效果的影響如圖1所示。

圖1 12%Na2CO3用量對沒食子酸標準溶液顯色效果的影響Fig.1 Effect of 12%Na2CO3on the color effect of the standard solution of the gallic acid

由圖1可見，吸光度隨著12%Na2CO3用量的增加而增加，12%Na2CO3用量增加到2.0 mL時，吸光度最大，此時12%Na2CO3溶液的用量與福林-酚試劑的用量的體積比為2∶1，繼續增加12%Na2CO3的用量，吸光度略有下降最終趨于平緩，所以可以認為當12%Na2CO3溶液的用量與福林-酚試劑的用量體積比為2∶1時，顯色比較完全。

2.1.2 福林-酚試劑用量的確定

堿性溶液中，北冰紅山葡萄中的多酚類化合物被福林酚試劑中的鎢鉬酸定量氧化，自身被還原生成藍色化合物，底物顯色的完全與否與福林-酚試劑的用量有直接關系，若用量不足，會導致顯色不完全。福林-酚試劑對反應顯色效果的影響如圖2所示。

圖2 福林-酚試劑用量對沒食子酸標準溶液顯色效果的影響Fig.2 Effect of Folin-phenol on the color effect of the standard solution of the gallic acid

由圖2可見，吸光度隨福林-酚試劑用量的增加而增加，當用量增加到4 mL時吸光度趨于平穩，因此當福林-酚與反應液的體積比為4∶1時，顯色較為完全。

2.2 顯色溫度的確定

溫度極易影響多酚物質自身結構，多酚物質在較高的溫度體系里極易分解，若溫度較低，也會影響酚類物質與福林-酚試劑的反應情況，并且不同物質所含的多酚種類和數量不一樣，所以應針對樣品確定相應的顯色溫度。溫度對顯色效果的影響如圖3所示。

圖3 反應溫度對樣品顯色效果的影響Fig.3 The influence of reaction temperature on the color efficiency for specimen

由圖3可見，在較低的溫度條件下，吸光度較小，說明此時反應緩慢，低溫抑制了酚類物質與福林-酚試劑的反應，隨著反應溫度的增加，吸光度不斷增加，說明此時該反應不再受溫度的抑制，當溫度為20℃時，吸光度最大，當溫度大于20℃時，吸光度逐漸降低，說明此時多酚物質受溫度的影響已經分解。因此該反應的最佳溫度為20℃。

2.3 顯色時間的確定

多酚物質的顯色需要一定時間，多酚物質反應是否完全與反應時間有直接關系，反應時間對顯色程度的影響如圖4示。

圖4 反應時間對樣品顯色效果的影響Fig.4 The influence of reaction time on the color efficiency for specimen

由圖4可見，在4 h以內顯色不完全，隨時間增加，吸光度明顯增加，4 h時達到最大，4小時后隨時間的增加吸光度趨于平穩，在誤差范圍內差異不顯著，即可以認為反應時間為4 h時，顯色完全。

2.4 標準曲線的建立及樣品的測定

總多酚測定的標準曲線如圖5所示。

圖5 北冰紅總多酚測定的標準曲線Fig.5 Standard curve for the total polyphenol determination of Vitis amurensis Rupr（Beibinghong）

線性關系為y=6.850x-0.076，R2=0.9994，線性良好。式中：y為沒食子酸標準液的濃度，單位為mg/L，x為吸光度。在測量樣品中多酚含量時，在相同的反應條件下測定樣品的吸光度，通過公式算出樣品溶液中多酚的濃度，計算樣品中多酚含量。

式中：W為北冰紅葡萄樣品中總多酚的含量，mg/g；C為沒食子酸標準液的濃度，mg/L；V為提取液體積，mL；N反應液體積，mL；M為每次處理樣品的質量，g。

按標準曲線的測定方法分別測定不同日期的北冰紅溶液（1.0 mL），通過公式計算出沒食子酸標準液的濃度，分別計算出樣品北冰紅葡萄中的多酚含量，其變化規律見圖6。

圖6 北冰紅轉色至冰凍時期總酚含量的變化趨勢Fig.6 Variation tendency of total phenols content of Vitis amurensis Rupr（Beibinghong）coloring and frost period

由圖6可見，總酚含量在2016年8月17日時為0.437 mg/g，隨后呈現逐步上升的趨勢，在10月21日多酚含量達到最高（1.622 mg/g），然后逐漸降低，11月30日采摘日時總酚含量降至1.105 mg/g。整體來說，在北冰紅轉色至冰凍期，總酚含量呈現先增后降的趨勢，在成熟末期總酚含量達到最高。出現這種現象的原因可能是在轉色至成熟期，北冰紅山葡萄不斷生長，酚類物質的合成速率大于其分解速率，因此總酚含量逐漸增加。而成熟至冰凍期，北冰紅山葡萄停止生長，無生命體征，但是依然進行呼吸作用等活動，導致酚類物質的分解速率大于合成速率，因此總酚含量逐漸降低。而李阿英等[16]研究發現，在葡萄整個生長發育過程中白藜蘆醇含量呈先逐漸增長達到峰值后逐漸下降的趨勢，并且王美麗等[17]研究發現，在不同葡萄漿果成熟過程中，沒食子酸、兒茶素、丁香酸等酚類物質的變化規律都不相同。因此其總酚的變化規律也不一定是單一的逐漸增加或降低，所以影響北冰紅總酚含量變化的因素有很多種，還有待進一步研究。

2.5 分析方法的評價

2.5.1 精密度試驗

精密度試驗結果見表1，通過表1可知，該方法精密度良好。

表1 精密度試驗Table 1 Precision experiment

2.5.2 重復性試驗

重復性試驗見表2。

表2 重復性試驗Table 2 Repetitive experiment

2.5.3 穩定性試驗

穩定性試驗見表3。

表3 穩定性試驗Table 3 Stability experiment

由表3可知，該分析方法穩定性良好。

2.5.4 加標回收試驗

加標回收試驗見表4。

表4 加標回收試驗Table 4 Average spiked recovery of total polyphenols experiment

從表4可以看出各組的加標回收率都在99%以上，RSD為1.03%，則說明該分析方法準確可靠，可用于北冰紅葡萄果實總多酚含量的測定。

3 結論

福林-酚比色法測定北冰紅葡萄總酚含量的最佳條件為：樣品∶福林-酚試劑∶12%（質量比）Na2CO3溶液=1∶4∶8（體積比），溫度 20℃，反應 4 h，測定方法的平均回收率為99.91%，RSD為1.03%。該方法適合北冰紅葡萄樣品總多酚含量的測定。

用福林-酚比色法分別測定不同時期的北冰紅山葡萄果實中的總酚含量，可知隨著葡萄果實的發育，總多酚的含量逐漸增加，直至10月21日（1.622 mg/g）左右達到最大，從10月21日至11月30日總多酚的含量逐漸降低，但降幅不明顯。

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