貴州特色苦蕎食品黃酮與免疫調節作用評價

李勇，曾海英，2，*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省薏苡工程技術研究中心，貴州貴陽550025）

隨著人們生活質量的提高，社會對健康的意識逐漸增強，保健食品越來越受到人們的喜愛，蕎麥作為一種藥食同源的雜糧不僅營養豐富而且具有很強的保健作用，現代研究表明：苦蕎黃酮有降血糖血脂、抗疲勞、抗缺血、抗氧化、增強機體免疫力等多種保健作用[1-3]。盡管苦蕎黃酮保健作用強，但不同產品、不同工藝，苦蕎食品黃酮的保留率及保健功效特性等是否存在較大差異，或蕎麥的添加量與苦蕎食品的保健功效關聯性等研究均未見報道。因此，本研究著眼于貴州蕎麥，以地方特色蕎食為研究對象，通過對苦蕎茶、苦蕎米、苦蕎面粉、苦蕎掛面以及苦蕎羹5類蕎食進行黃酮組分分析，并對其免疫調節作用進行綜合評價，采用模糊數學綜合評價法得出5類蕎食的免疫調節作用差異性，探討黃酮含量與免疫調節作用的關聯性，為貴州特色苦蕎食品的研發與推廣提供前期研究數據及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎米、苦蕎茶、苦蕎面粉、苦蕎掛面、苦蕎羹：貴州省內苦蕎生產企業；KM小鼠，6周～8周齡，雌雄各半，SPF級，體重18 g～22 g：重慶騰鑫生物技術有限公司，實驗動物合格證號為：SCXK（軍）2012-0011；免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）測定試劑盒：上海鼓臣生物技術有限公司；2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）：成都西亞試劑有限公司；環磷酰胺：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；瑞氏染料：天津市光復精細化工研究所；雞紅細胞、補體（豚鼠血清）：貴州大學釀酒與食品工程學院貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室自制。

1.2 儀器與設備

1220型液相色譜儀：美國安捷倫公司；TU-1810紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機：長沙邁佳森儀器設備有限公司；光吸收酶標儀SpectraMax 190：美谷分子儀器（上海）有限公司；MoticAE31倒置相差顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品黃酮類成分測定

樣品處理：取經粉碎樣品1 g，用60%的乙醇，料液比1∶25（g/mL），50℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加5 mL 60%乙醇清洗然后離心合并上清液重復3次，于50 mL容量瓶中定容，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液備用。

色譜條件：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0.4%磷酸溶液（1∶1，體積比），流速：1.0 mL/min，柱溫：35.0℃，檢測波長：360 nm，進樣量：20 μL。

標準曲線：精密稱取蘆丁對照品20.00 mg，槲皮素對照品4.00mg，山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照品4.00 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，取 0.5、1.0、1.5、2.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液濃度分別為 0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL，山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素對照品溶液濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL。通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品乙醇提取物制備

取經粉碎樣品100 g，60%乙醇，料液比1∶25（g/mL），50℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加200 mL 60%乙醇搖勻然后離心合并上清液，真空濃縮至5 g，即1 g醇提樣品相當于20 g原樣。

1.3.3 構建小鼠免疫低下模型

參照肖雪筠[4]等方法稍作修改，KM小鼠，隨機分為空白對照組、環磷酰胺對照組、其中苦蕎茶組（tartary buckwheat tea group，TBT）、苦蕎米組（tartary buckwheat rice group，TBR）、苦蕎面粉組（tartary buckwheat flour group，TBF）、苦蕎掛面組（tartary buckwheat noodles group，TBN）、苦蕎羹組 （tartary buckwheat paste group，TBP），各設置高、中、低 3個灌胃劑量組，灌胃劑量分別為 600、300、150 mg/kg·bw，每組 10 只。各組小鼠腹腔注射環磷酰胺溶液，注射量為60 mg/kg·bw，空白對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續3 d，構建環磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。小鼠免疫功能低下模型建立后，實驗各組按照各自劑量灌胃，空白對照組及環磷酰胺對照組灌胃等劑量的生理鹽水。

1.3.4 脾臟和胸腺指數的測定

小鼠連續灌胃9天后，禁食不禁水，24小時后，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺，稱重記數，計算脾臟指數及胸腺指數。脾臟指數＝脾臟重量（mg）/體重（g），胸腺指數＝胸腺重量（mg）/體重（g）。

1.3.5 血清中IgG、IgM含量的測定

小鼠連續灌胃10天后，摘眼球取血，1500 r/min離心10 min，取血清，然后按照IgG、IgM測定試劑盒的使用說明書進行。

1.3.6 血清溶血素水平的測定

小鼠連續灌胃6天后，各鼠腹腔注射2%的雞紅細胞混懸液0.2 mL，4天后，摘眼球取血，1500 r/min離心10 min，取血清，用生理鹽水稀釋至100倍，取1 mL，加10%的雞紅細胞懸浮液0.5 mL、10%的補體1 mL，混合均勻于37℃水浴30 min，置0℃冰箱中中止反應。1500 r/min離心5 min，取上清液于450 nm處測吸光度值。與不加血清的生理鹽水試管作對照。頸椎脫臼處死小鼠。

1.3.7 耳腫脹率的測定

小鼠連續灌胃6天后，于腹部涂抹8%的硫化鈉去毛，均勻涂抹 5%DNFB 50 μL，3天后，于小鼠左耳均勻涂抹1%DNFB 20 μL，于右耳均勻涂抹20 μL丙酮溶液進行對照，24小時后，頸椎脫臼處死，用打孔器取直徑8 mm的耳片，稱重，計算腫脹率，腫脹率/%=（左耳/右耳-1）×100。

1.3.8 單核-巨噬細胞功能的測定

小鼠連續灌胃6天后，每只小鼠腹腔注射4%的淀粉肉湯1 mL，以引誘體內的巨噬細胞向腹腔聚集；間隔2小時后，每只小白鼠注射1%的雞紅細胞懸液1 mL。再間隔2 h，頸椎脫臼處死，室溫保持在27℃避免尸體僵硬，剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水 2 mL，用手輕柔5 min，吸取腹液1 mL均勻涂于載玻片上，立即37℃孵育30 min，用生理鹽水緩慢沖洗1 min，吹干，染色進行觀察。

計數：油鏡下觀察，以巨噬細胞數200個為記數范圍，同時記數其中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數，記錄結果，計算吞噬率，吞噬率/%=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞/200×100。

2 結果與分析

2.1 樣品黃酮類成分測定

樣品、混合對照品色譜圖見圖1，樣品黃酮類成分測定見圖2。

圖1 樣品、混合對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of samples and mixed reference substances

圖2 樣品黃酮類成分測定Fig.2 Determination of samples flavonoids

由圖2可以看出，不同苦蕎食品中總黃酮由蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素組成，蘆丁為主要成分，且含量呈顯著性差異（P＜0.05）?？嗍w茶的總黃酮、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量最高，分別為19.83、19.04、0.67 mg/g；苦蕎羹的槲皮素含量最高，達0.87 mg/g。

2.2 乙醇提取物對小鼠脾臟和胸腺指數的影響

脾屬于外周免疫器官，是動物體內最大的免疫器官。胸腺屬于中樞淋巴器官，是T細胞分化成熟的主要場所，胸腺指數、脾臟指數的大小可反映機體免疫功能的強弱[5-6]，各蕎食醇提物對小鼠脾臟和胸腺指數的影響見表1。

表1 乙醇提取物對小鼠脾臟和胸腺指數的影響（M±SD，n=10）Table 1 Effects of ethanol extract on mouse spleen and thymus index（M±SD，n=10）mg/g

由表1可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組脾臟和胸腺指數較模型對照組均有所增加，且呈現劑量效應。TBT、TBR高劑量組胸腺指數增加顯著（P＜0.05），其中TBT高劑量組胸腺指數最高，達4.99 mg/g；TBT、TBR高劑量組脾臟指數增加極顯著（P＜0.01），其中TBT高劑量組脾臟指數最高，達7.78 mg/g。表明各蕎食醇提物能修復小鼠脾臟和胸腺或促進其發育，其中TBT效果最明顯。

2.3 乙醇提取物對小鼠IgG、IgM含量的影響

免疫球蛋白是免疫活性分子中的一類，按結構分為5類，分別稱免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白D（immunoglobulin D，IgD）和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE），其中 IgG、IgM 的含量高、分布廣，是全身性體液免疫反應的主要效應分子，IgG、IgM的含量高低可反映出機體體液免疫能力的強弱[7]，各樣品醇提物對小鼠IgG、IgM含量的影響見表2。

表2 乙醇提取物對小鼠IgG、IgM含量的影響（M±SD，n=10）Table 2Effects of ethanol extract on mouse IGG、IGM conten（tM±SD，n=10） mg/100 mL

由表2可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組IgG、IgM含量較模型對照組均有所增加，且呈現劑量效應。TBT、TBR、TBF、TBP高劑量組、TBT、TBR中劑量組IgG含量增加極顯著（P＜0.01），TBF 中劑量組增加顯著（P＜0.05），其中TBT高劑量組IgG含量最高，達1092.71 mg/100 mL；TBT、TBR、TBF高劑量組IgM含量增加極顯著（P＜0.01），TBP 高劑量組、TBT、TBR、TBF 中劑量組增加顯著（P＜0.05），其中TBT組IgM含量最高，達 168.75 mg/100 mL。表明各蕎食醇提物均可提高血清中IgG、IgM含量，其中以TBT組的效果最為明顯。

2.4 乙醇提取物對小鼠血清溶血素水平的影響

溶血素是指任何能使紅細胞溶解并釋放出血紅蛋白的物質，屬于特異性體液免疫，血清中溶血素含量能反映出機體體液免疫能力的強弱[8-9]，各樣品醇提物對小鼠血清溶血素水平的影響見表3。

由表3可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組血清溶血素水平較模型對照組均有所提高，且呈現劑量效應。TBT、TBR、TBF高劑量組、TBT中劑量組提高極顯著（P＜0.01），TBP 高劑量組、TBR、TBF 中劑量組顯著 （P＜0.05），其中TBT組血清溶血素OD450值最高，達0.49。表明各蕎食醇提物均可提高血清溶血素水平，其中TBT組的效果最為明顯。

表3 對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響（M±SD，n=10）Table 3 Effects of ethanol extract on mouse serum hemolysin levels（M±SD，n=10）

2.5 乙醇提取物對小鼠耳腫脹率的影響

遲發型過敏反應屬于細胞免疫，當抗原進入機體后，機體產生致敏淋巴細胞，當再次受到同一抗原刺激后，單核-巨噬細胞向局部聚集和吞噬抗原而引起皮膚局部腫脹的一種反應，其腫脹厚度可反映細胞免疫功能的強弱[10-11]，各樣品醇提物對小鼠耳腫脹率的影響見表4。

由表4可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組耳腫脹率較模型對照組均有所增加，且呈現劑量效應。TBT、TBR、TBF高劑量組增加極顯著（P＜0.01），TBP高劑量組TBT、TBR、TBF中劑量組增加顯著（P＜0.05）。其中TBT組耳腫脹率最高，達122.09%。表明各蕎食醇提物均可提高耳腫脹率，其中以TBT組的效果最為明顯。

表4 乙醇提取物對小鼠耳腫脹率的影響（M±SD，n=10）Table 4 Effects of ethanol extract on mouse ear swelling rate（M±SD，n=10）

2.6 乙醇提取物對小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響

單核-巨噬細胞能對外來異物進行識別和清除，具有強大的吞噬殺傷作用，吞噬率可以反映機體非特異性免疫功能的強弱[12-13]，各樣品醇提取物對小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響見表5。

表5 乙醇提取物對小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響（M±SD，n=10）Table 5 Effects of ethanol extract on mouse mononuclearmacrophage phagocytic rate（M±SD，n=10）

由表5可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組吞噬率較模型對照組均有所增加，且呈現劑量效應。TBT、TBR、TBF高劑量組增加極顯著（P＜0.01），其中TBT組耳腫脹率最高，達49.20%。表明各蕎食醇提物均可提高吞噬細胞吞噬率，其中以TBT組的效果最為明顯。

2.7 模糊數學綜合評價

由于免疫學評價方法涉及多個指標，很難用單一的標準評價5種苦蕎食品的免疫調節作用的強弱，模糊分析法可以按照單因素中各指標間的隸屬度關系，各因素的對實驗結果的貢獻率，建立模糊評價的函數，對多個因素結果進行處理，得到最終模糊總評，所以采用模糊數學綜合評價5種苦蕎食品免疫調節作用的強弱。

2.7.1 因素集及權重集

由2.2～2.6分析結果可知，各蕎食醇提物與免疫調節作用存在劑量效應，且以高劑量組免疫調節作用最強，在此以各蕎食醇提物高劑量組免疫學評價指標為因素集，即U={腺指數，脾臟指數，IgG含量，IgM含量，血清血溶素水平，耳腫脹率，吞噬率}；綜合考慮腺指數、脾臟指數、IgG含量、IgM含量、血清學溶素水平、耳腫脹率、吞噬率7個指標的重要性程度分配權重集為α={0.1，0.1，0.1，0.1，0.2，0.2，0.2}。

2.7.2 單因素隸屬度函數及隸屬度矩陣

本研究用環磷酰胺構建小鼠免疫低下模型，按免疫學評價方法判定5種苦蕎食品免疫調節作用，各項指標大小均介于模型組與空白組之間，則實驗組各指標相對于空白組與模型組的大小可以代表其免疫調節作用的強弱，所以屬度函數采用升半梯型函數模型，見圖3，式（1）。

圖3 升半梯型函數模型Fig.3 Ascending ladder type function model

式中：rij為第i個因素指標第j個樣品的隸屬度，且0≤rij≤1；b為第i個因素指標的最大值，即空白對照組；a為第i個因素指標的最小值，即模型對照組。

根據式（1）得出隸屬度矩陣（R），式（2）。

根據（2）結合2.2～2.6實驗數據，計算結果見評價矩陣（3）

選取評價函數（4），α 為權重集 α={0.1，0.1，0.1，0.1，0.2，0.2，0.2}，得出總評價 S，見表6。

表6 模糊數學綜合評價結果Table 6 Comprehensive evaluation result of fuzzy mathematics

根據表6可知，TBT、TBR、TBF、TBN、TBP 組模糊總評結果均為正數，說明各蕎食醇提物均能提高免疫低下小鼠的免疫活性，其中TBT組評分最高，達71.13分。表明各蕎食醇提物均有免疫正向調節作用，其能力依次為苦蕎茶＞苦蕎米＞苦蕎面粉＞苦蕎羹＞苦蕎掛面。

2.8 樣品黃酮總量與免疫調節作用關聯性分析

黃酮總量與模糊總評間的關系見圖4。

圖4 黃酮總量與模糊總評間的關系Fig.4 Relationship between total flavonoids and fuzzy total evaluation

根據圖4可知，蕎食總黃酮含量與免疫調節模糊總評間呈極顯著（r=0.989，P＜0.01）的關聯性。表明各蕎食醇提物能增強免疫低下小鼠的免疫能力，且與其黃酮含量呈正相關。前人大量研究也均表明，苦蕎黃酮可增強機體的非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫功能，提高機體的免疫能力[4，14-15]。

3 結論

由實驗結果可知，貴州5種苦蕎食品醇提物各劑量組均可提高免疫低下小鼠的胸腺指數和脾臟指數、血清中IgG、IgM含量、血清血溶素水平、耳腫脹率及單核-巨噬細胞吞噬率，說明貴州5種苦蕎食品具有一定的免疫調節作用。5種苦蕎食品免疫調節功效不一，且具劑量效應，并與其黃酮含量呈極顯著的關聯性（P＜0.01）。說明苦蕎食品醇提物的免疫調節作用與黃酮含量呈正相關，但苦蕎食品醇提物究竟是哪種成分在調節免疫功能方面發揮著作用，還需實驗去進一步探討與驗證。

[1] 趙震宇,劉平懷,馬莎莎,等.藥食同源植物牛大力的研究進展[J].食品科學,2017,38(9):293-306

[2] 譚玉榮,陶兵兵,關郁芳,等.苦蕎類黃酮的研究現狀及展望[J].食品工業科技,2012,33(18):377-381

[3]方玉梅,譚萍.六盤水苦蕎麥黃酮的體外抗氧化活性的研究[J].食品研究與開發,2017,38(11):5-8

[4] 宋金星,薛協超,黨冰怡,等.0～28日齡SPF仔大鼠免疫功能變化規律的研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2017(9):245-247

[5] 張文蘭,白力,胡同平.抗IgG、IgM、IgA型心磷脂抗體和抗β2糖蛋白1抗體在系統性紅斑狼瘡患者中的意義[J].免疫學雜志,2017(1):59-62

[6]Hossain M K,Wall K A.Immunological Evaluation of Recent MUC1 Glycopeptide Cancer Vaccines[J].Vaccines,2016,4(3):25

[7] 吳高峰,黃占旺,劉宛玲,等.納豆菌制劑對抗生素介導小鼠的免疫調節作用及細胞因子分泌的影響[J].中國食品學報,2018(2):22-29

[8] 李自輝,張寧,董婉茹,等.玄參多糖對正常生理小鼠和免疫低下狀態小鼠免疫功能的影響[J].中國藥房,2017,28(10):1316-1319

[9]Xu X,Bi D,Wan M.Characterization and Immunological Evaluation of Low-Molecular-Weight Alginate Derivatives[J].Current Topics in Medicinal Chemistry,2016,16(8):874-887

[10]周茜,吳夢穎,王唯霖,等.多糖型扇貝沙司對小鼠免疫功能和抗氧化活性的影響[J].中國食品學報,2018(2):30-36

[11]Aira L E,Hernández P,Prada D,et al.Immunological evaluation of rheumatoid arthritis patients treated with itolizumab[J].Mabs,2016,8(1):187-195

[12]李虹霞,楊蜜蜜,劉伏山,等.復方甘草酸苷對自身免疫性肝炎患者肝臟單核巨噬細胞吞噬功能的影響及機制[J].山東醫藥,2017,57(24):31-33

[13]張靜,楊旭東,郭麗君,等.利用隸屬函數法分析葛根種質資源品質的研究[J].中藥材,2017,40(6):1314-1317

[14]王強,張乃鋒,崔凱,等.植物乳桿菌和苦蕎黃酮及其復合物對斷奶仔豬生長性能、營養物質消化率及血清指標的影響[J].動物營養學報,2018(1):170-179

[15]張濤,張廷,張永霞.一種清熱降壓苦蕎茶飲及其制備方法:CN106260335A[P].2017-01-04