三株乳酸桿菌的分離鑒定與益生特性研究

梁東梅 ，李玉鵬 ，杜艷芬 ，朱 琪 ，安建勇 ，崔茂盛 ，李治欣，喬家運，楊卓婧，王文杰，李海花 *

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381；3.賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，上海 201206；4.河南省洛陽市老城區動物衛生監督所，河南洛陽471000）

腸道是機體最大的免疫器官，是防御外來病原菌感染的第一道防線（Ohland和Macnaughton，2010）。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的主要危害仔豬腸道健康的一種多發病。雖然利用抗生素能夠預防該病的發生，但是長期使用也會產生諸多的負面效應（Cameron等，2016），因此提高仔豬自身抵抗力是有效防控仔豬大腸桿菌病的有效途徑。乳酸桿菌是仔豬腸道中最早定植的菌群之一，其能產生抑菌物質，維持腸道菌群平衡（Ren等，2015），改善仔豬腸道屏障 （劉海鴻等，2017），增強仔豬免疫力（周建國等，2014），減輕致病菌引起的腸道損傷，提高生長性能 （Qiao等，2015；Yang等，2014），有望替代抗生素在仔豬飼糧中使用。本研究從健康豬糞便中分離鑒定出三株乳酸桿菌，并利用豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）模

型，研究了這三株乳酸菌在IPEC-J2細胞上黏附的特點、對致病性大腸桿菌的生長抑制作用和黏附抑制作用，并進行了比較，為在仔豬飼糧中選擇性添加使用該乳酸菌提供了依據，為深入研究乳酸桿菌調節仔豬腸道屏障功能奠定了基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 細胞和菌株 產腸毒素大腸桿菌（ETEC）K88菌株購買于中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心。豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）株購買于上海冠導生物工程有限公司。

1.2 主要試劑 RPMI Medium 1640 basic培養液、胰蛋白酶EDTA消化液和胎牛血清均購自美國Gibco公司，青鏈霉素、PBS緩沖液、硫酸慶大霉素和TritonX-100均購自北京索萊寶生物公司，TRIzol試劑盒、Taq 酶、10×buffer、dNTPs 均購買于上海生工生物工程股份有限公司，MRS培養基和LB培養基均為自制。

1.3 乳酸桿菌分離 無菌條件下取28日齡健康斷奶仔豬新鮮糞便10 g，平均分成兩份，一份放入凍存管中-80℃保存，另一份在超凈工作臺中用無菌生理鹽水稀釋至10-4、10-5和10-6梯度，分別取0.2 mL糞便稀釋液接種于選擇性培養基MRS中，置于37℃恒溫培養箱中培養24 h。挑取形態疑似的單克隆菌落在MRS上繼續培養，然后不斷挑取單克隆菌落進行劃線，直至得到純凈單一菌落。

1.4 乳酸桿菌生理生化及PCR鑒定 依照 《伯杰氏細菌鑒定手冊》觀察菌株的形態并測定其生化反應 （布壩南和吉本斯，1984）。根據乳酸桿菌16S rRNA保守序列，采用Primer 5.0軟件設計特異性引物 （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用TRIzol試劑盒提取細菌基因組DNA，并以之為模板，利用乳酸菌鑒定的引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為（50 μL）：Taq 酶（5 U/μL）1 μL，DNA模板 2 μL，10×buffer 5 μL，上、下游引物各 1 μL，dNTPs（10mM each）1 μL，PCR 水 39 μL。 PCR 反應程序：94 ℃ 5 min、94 ℃ 25 s、62 ℃ 25 s、72 ℃1 min 30 s、40個循環，72 ℃終延伸 3 min、16 ℃2 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。將PCR產物純化后送金唯智生物公司進行核苷酸序列測定，測序結果與GenBank數據庫中的參考菌株序列進行比對，確定所分離的三株乳酸桿菌的屬種。

1.5 乳酸桿菌抑菌活性能力的測定 活菌計數法：將三株乳酸桿菌分別接種于MRS液體培養基，37℃靜置過夜培養，然后5000 r/min 4℃離心10 min，收集培養上清液，置4℃保存備用。將上述三株乳酸菌培養上清液分別與大腸桿菌溶液（濃度為 1.68×109cfu/mL）混合作用，作用時間分別為 0、5、15、30 min 和 60 min， 然后將大腸桿菌凃布LB培養板，37℃過夜培養后，進行菌落計數。每個菌株的每個時間點分別做3次重復。

牛津杯法 （杜金城等，2016)：在直徑10 cm培養皿中加入15 mL含2%瓊脂的無菌水，靜置。待瓊脂凝固后，用無菌鑷子把牛津杯等距離放入培養皿中。將大腸桿菌（1×108cfu/mL）及LB固體培養基（10 mL）混勻倒入培養皿中，待其凝固后將牛津杯取出，并分別將三種乳酸桿菌培養上清液（150 μL）加入牛津杯孔中，其中每個菌株做3個重復，用MRS培養液做空白對照。將培養皿置4℃冰箱2 h，待培養上清液擴散后，將培養皿轉入37℃培養箱中培養24 h，然后測定抑菌圈直徑。

1.6 乳酸桿菌黏附豬小腸上皮細胞能力測定用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI Medium-1640 basic培養基培養IPEC-J2細胞，培養條件是37℃、5%CO2，待細胞生長至對數生長期時，消化細胞并接種于兩塊24孔細胞培養板（細胞濃度為3×105個/孔），待細胞生長密度至50%，分別加入植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌（濃度均為5×107cfu/孔），置細胞培養箱分別孵育3、6 h和24 h，棄去培養液，用不含血清的DMEM清洗3次以去除未黏附的乳酸桿菌，然后向其中一塊培養板每孔加入100 μL 0.5%TritonX-100，37℃孵育8 min以裂解細胞，再加入900 μL PBS終止裂解，吹打混勻后吸出樣品。將樣品進行梯度稀釋后，涂布MRS培養板厭氧培養48 h，進行乳酸桿菌計數，此時乳酸桿菌數（C1）為IPEC-J2細胞吞噬和黏附的乳酸菌總數；另一塊培養板每孔加入含100 μg/mL慶大霉素的培養液0.4 mL，孵育2 h。棄去慶大霉素，按照上述方法裂解細胞并終止反應，并對乳酸桿菌進行培養和計數，此時乳酸桿菌數 （C2）為IPEC-J2細胞吞噬的乳酸桿菌數。黏附的乳酸菌活菌數量=乳酸桿菌數C1-乳酸桿菌數C2。

1.7 乳酸桿菌抑制大腸桿菌黏附豬小腸上皮細胞能力的測定 將IPEC-J2細胞分別接種于兩塊 24孔培養板（細胞濃度為3×105個/孔），待細胞生長密度至50%，分別加入植物乳桿菌、唾液乳桿菌及嗜酸乳桿菌 （濃度為5×107cfu/孔），孵育細胞6 h，分別用大腸桿菌K88（濃度為5×106cfu/孔）刺激細胞 0、3、6 h 和 24 h。 刺激結束后按照乳酸桿菌黏附豬小腸上皮細胞能力試驗中的方法對細胞進行裂解和大腸桿菌計數。黏附的大腸桿菌活菌數量=大腸桿菌數C1-大腸桿菌數C2。

1.8 統計分析 使用Excel和SPSS 20.0軟件進行數據統計分析，比較不同乳酸桿菌不同時間點黏附IPEC-J2細胞的能力以及乳酸桿菌抑制大腸桿菌K88黏附IPEC-J2細胞能力是否具有顯著性差異。試驗結果以“平均值±標準差”表示。采用單因素ANOVA進行方差分析，并采用t檢驗進行組間差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態學觀察 分離純化的乳酸桿菌菌株經37℃厭氧培養24 h后，呈圓形凸起、不透明、乳白色或灰白色、邊緣整齊光滑的單菌落，經過革蘭氏染色鏡檢，初步判定分離菌株為桿狀的革蘭氏陽性菌。對單個菌落進行劃線保存，得到三株純凈單一菌落，編號分別為L1、L2、L3。

2.2 乳酸桿菌生化及PCR鑒定 三株分離菌株生化鑒定結果如表1，根據 《伯杰氏細菌鑒定手冊》確定編號L1、L2、L3為乳酸桿菌。

表1 三株分離菌株生化試驗結果

瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，乳酸桿菌L1、L2和L3的PCR擴增條帶大小分別約1500 bp，與預期產物條帶大小相符。將目的條帶進行膠回收純化并測序，測序結果在NCBI數據庫中經過BLAST比對，結果發現，L1菌株與植物乳桿菌同源性達99.45%，L2菌株與唾液乳桿菌同源性達99.36%，L3菌株與嗜酸乳桿菌同源性達98.21%，因此本研究分離的乳酸桿菌L1、L2和L3菌株分別為植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌。

圖1 三株菌16SrRNAPCR擴增產物電泳結果

2.3 乳酸桿菌抑制大腸桿菌能力的測定 三株乳酸桿菌培養上清液抑制大腸桿菌能力的結果見表2和表3。如表2所示，植物乳桿菌抑菌圈直徑為30.8 mm，唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌抑菌圈直徑分別為18.7、16.6 mm，可見三株乳酸桿菌培養上清液對大腸桿菌均有良好的抑制效果，其中以植物乳桿菌的抑菌效果最好，同時MRS培養液對照組的抑菌圈直徑為0 mm，說明MRS培養液對大腸桿菌無抑制作用。活菌計數法結果如表3所示，與植物乳桿菌作用0 min相比，植物乳桿菌作用 5、15、30 min和60 min后抑菌力均是 100%；與唾液乳桿菌作用0 min相比，唾液乳桿菌作用5、15、30 min和 60 min后抑菌力分別提高了20%、21%、24%和52%；與嗜酸乳桿菌作用0 min相比，嗜酸乳桿菌作用5、15、30 min和60 min后抑菌力分別提高了9%、18%、24%和51%，并且隨著乳酸桿菌作用時間的延長其抑菌效果也最明顯，牛津杯法和活菌計數法檢測的抑菌效果一致。試驗數據表明，三株乳酸桿菌能夠有效抑制大腸桿菌生長，其抑菌能力強弱依次是植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌。

表2 牛津杯法測三株乳酸桿菌抑制大腸桿菌能力的結果mm

表3 活菌計數法測三株乳酸桿菌抑制大腸桿菌能力的結果109cfu/mL

2.4 乳酸桿菌黏附IPEC-J2細胞能力的測定三株乳酸桿菌黏附IPEC-J2細胞能力的結果如表4，與植物乳桿菌作用細胞3 h相比，植物乳桿菌作用細胞6 h和24 h時其黏附數分別增加了18%和7%；與唾液乳桿菌作用細胞3 h相比，唾液乳桿菌作用細胞6 h和24 h時其黏附數分別增加了23%和15%；與嗜酸乳桿菌作用3 h相比，嗜酸乳桿菌作用細胞6 h和24 h時其黏附數分別增加了18%和13%。與乳酸桿菌作用3 h相比，三株乳酸桿菌作用細胞6 h和24 h時其黏附數均顯著增加，并且以乳酸桿菌作用6 h時的黏附數為最多。試驗數據表明，三株乳酸桿菌對IPECJ2細胞具有很好的黏附性，其中植物乳桿菌黏附性較好。

表4 三株乳酸桿菌黏附能力測定的結果log cfu/mL

2.5 乳酸桿菌對大腸桿菌黏附豬小腸上皮細胞的影響 乳酸桿菌對大腸桿菌黏附豬腸上皮細胞的影響結果如表5所示，與大腸桿菌刺激細胞0 min相比，大腸桿菌刺激細胞3、6 h和24 h時植物乳桿菌對其黏附數分別降低了16%、19%和6%，唾液乳桿菌對其黏附數分別降低了6%、16%和3%，嗜酸乳桿菌對其黏附數分別降低了4%、12%和3%，并且均以大腸桿菌刺激細胞6 h時三株乳酸桿菌對其黏附數降低為最多。試驗數據表明，三株乳酸桿菌能夠有效抑制大腸桿菌黏附豬小腸上皮細胞，其抑制能力強弱依次是植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌。

表5 三株乳酸桿菌對大腸桿菌黏附豬小腸上皮細胞測定的結果log cfu/mL

3 討論

3.1 三株乳酸桿菌抑菌能力 腸道微生物構成的屏障是腸道屏障的重要組成部分，對宿主腸道功能的發揮具有重要作用。乳酸桿菌在代謝過程中產生的乳酸、抗菌肽等有益物質，可顯著降低環境pH和氧化還原點位值，使腸內酸度增高，一方面促使主細胞分泌的胃蛋白酶原轉變為胃蛋白酶，還能提高胃蛋白酶活性，促進動物對蛋白質的消化吸收，從而提高飼料報酬、改善動物生長性能；另一方面能夠抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過氧化氫酶陽性細菌、大腸桿菌類和沙門氏菌等病原菌，調節腸道菌群平衡（黃奕雯等，2017；陳大衛等，2014）。由此可見，乳酸菌對于提高動物生產性能和健康水平具有十分重要的意義。本研究分別采用牛津杯法和活菌計數法分析獲得的三株乳酸桿菌的抑菌活性，結果表明三株乳酸桿菌對產腸毒素大腸桿菌具有很強的抑制作用，并且植物乳桿菌的抑菌能力明顯高于唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌，這與楊紅亞等（2013）和侯穎等（2017）報道一致，然而三株乳酸桿菌飼喂仔豬后能否有效抵抗大腸桿菌的感染還需要深入研究。研究表明，嗜酸乳桿菌飼喂仔豬后降低了直腸內容物中大腸桿菌的數量，增加了乳酸桿菌的數量（Qiao等，2015）。但也有研究結果表明，乳酸桿菌的加入并沒有本試驗抑菌效果明顯（杜金城等，2016），與本研究結果有差異，這可能是由于菌株不同、產酸能力不同以及抑制的病原菌不同等因素造成的差異。仔豬腸道除了面臨致病性大腸桿菌入侵的威脅外，還要面臨其他病原菌如沙門氏菌、鏈球菌、巴氏桿菌和丹毒桿菌等的威脅，因此，這三株乳酸菌對其他腸道病原菌的生長繁殖是否具有抑制作用還有待進一步研究。

3.2 三株乳酸桿菌黏附及競爭性黏附能力 乳酸桿菌發揮作用的關鍵是首先定植到細胞上，通過競爭營養及黏附部位阻擋病原菌與細胞表面受體的結合，或者黏附細胞后細胞釋放活性抑菌物質抑制病原菌黏附來調節豬腸道內菌群平衡，提高仔豬健康水平。由于在體內很難量化菌株對細胞的黏附，應用體外細胞培養試驗方法來反映菌株的黏附性能已成為公認的模式（García-Ruiz等，2014；Valeriano 等，2014）。本試驗選用豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）為模型，用分離的乳酸桿菌作用細胞后檢測其黏附性。結果表明，三株乳酸桿菌對腸上皮細胞均具有一定的黏附性，其中植物乳桿菌黏附性較好，這與Wang等（2017）的結果相一致。同時乳酸桿菌作用IPEC-J2細胞24 h時，其黏附細胞的能力均下降，這可能是由于培養液中的營養物用盡，或者是細菌表面與細胞膜外糖脂共價結合的膜磷壁酸減少，或者是細胞表面黏附受體達到飽和所引起的黏附力下降（趙靜等，2014），這一結果與吳凡等（2015）及劉海鴻等（2017）在乳酸桿菌作用細胞后2 h和4 h時黏附力開始下降有所不同，這可能是由于生長環境、菌株和細胞等的不同引起的差異，也可能是由于不同菌株在不同生長階段代謝產物不同所引起的黏附效果不同（向鑫玲等，2016）。在分析乳酸桿菌對大腸桿菌黏附豬小腸上皮細胞的影響時發現，三株乳酸桿菌與對照組相比均具有顯著抑制大腸桿菌黏附細胞的特性，這是由于乳酸桿菌黏附細胞后競爭營養及黏附部位阻擋了大腸桿菌與細胞表面受體的結合。然而當大腸桿菌刺激時間達24 h時，乳酸桿菌抑制大腸桿菌黏附細胞的能力下降，這可能是由于大腸桿菌釋放的內毒素對細胞產生了毒性作用，影響了細胞正常的生理功能。

綜上所述，分離的三株乳酸桿菌對豬腸上皮細胞具有良好的黏附能力，并可抑制產腸毒素大腸桿菌的生長和黏附豬小腸上皮細胞，為其在仔豬飼糧中的應用提供了依據，為深入研究乳酸桿菌調節仔豬腸道屏障功能奠定了基礎。

4 結論

從健康豬糞便中分離鑒定出三株乳酸桿菌分別是植物乳桿菌、唾液乳桿菌和嗜酸乳桿菌，三株乳酸桿菌能夠有效抑制致病性大腸桿菌的生長，具有黏附豬小腸上皮細胞的特性，并能夠有效抑制致病性大腸桿菌黏附于豬小腸上皮細胞。

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