一株枯草芽孢桿菌的鑒定及胞外多糖活性研究

張玲秀，白建華，郝瑞林，董社琴

（忻州師范學院生物系，山西忻州 034000）

多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物，廣泛存在于植物、真菌、藻類和細菌中。細菌胞外多糖是細菌產生的一類重要的生物大分子（趙霞等，2016），由于其具有抗菌、抗氧化性、免疫調節和抗癌等功能而備受關注（Zhang等，2016）。研究表明，從家蠅體內篩選出的枯草芽孢桿菌，其所產胞外多糖具有很強的清除氧自由基能力和抑真菌能力（張玲秀等，2013），因而本研究進一步對其所產胞外多糖進行多項活性檢測，以期在食品、藥物等方面提供可用活性物質，從而對枯草芽孢桿菌多糖的開發奠定理論基礎，也為有益微生物的資源進一步開發提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源 前期家蠅體內篩選所得，低溫保存。

1.1.2 培養基 LB固體和液體培養基 （周德慶，2006）。

1.1.3 試劑及儀器 LB固體和液體培養基購于北京奧博；引物1492r及27f和葡聚糖G-75購于Solarbio；小鼠白細胞介素-2（IL-2）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒 購于Biovision，其余均為國產分析純。752N紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；PCR儀（杭州博日）；高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司，HC-2062）。

1.1.4 試驗動物及飼養條件 昆明種小白鼠，6周齡，體重約23 g，雄性，購于山西醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（晉）2009-001。飼養環境溫度為18～29℃，相對濕度為40%～70%，自然通風，每天更換飲食和墊料。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種鑒定 從菌落形態和菌體顯微形態結構觀察和16S rDNA的序列同源性比進行鑒定（Houda 等，2017）。

1.2.2 細菌胞外多糖提取及純化 采用Sevag法除蛋白，乙醇沉淀胞外多糖，然后用丙酮洗滌脫水，冷凍干燥后得深棕色粉末狀固體，再經SephadexG-75凝膠柱層析純化，苯酚硫酸法和核酸蛋白儀跟蹤檢測獲得組分，冷凍干燥備用（伍渡清等，2013）。

1.2.3 胞外多糖對小鼠抗疲勞能力試驗 將試驗小鼠分為對照與給藥（多糖）兩組，每組10只，隨機分組。每日灌胃給藥量為50 mg/kg，對照組給等體積的無菌水，其他飼養條件相同，共飼養5 d。在第1天開始每天游泳訓練10 min（在水溫15～20℃、水深30 cm的紅色桶內），第5天給藥l h后，將小鼠進行負重耗竭游泳，記錄從游泳開始到小鼠不能上浮（即死亡）的時間。

1.2.4 免疫器官指數的測定（Kwak等，2003） 分組同上，給藥組每日灌胃多糖200 mg/kg，對照組采用同樣方法灌胃相同體積無菌水。15 d后對所有小鼠稱重。脫臼法處死小鼠，迅速的解剖小鼠并挑選出其胸腺和脾臟，用干凈的濾紙吸去殘留的血漬及其他雜質，并稱量，按下列公式計算免疫器官指數：

1.2.5 小鼠體液免疫指標白介素-2測定 分組和給藥方法同1.2.4所述，15 d后取試驗小鼠的血液，離心法分離血清，按照小鼠白細胞介素-2（IL-2）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒說明書試驗步驟，測定各組小鼠血清中白介素-2的含量。

1.2.6 小鼠巨噬細胞吞噬活性的測定 分組和給藥方法同1.2.4所述，15 d后小鼠稱重，每只小鼠尾靜脈注射0.1 mL用生理鹽水稀釋3倍的墨汁，注入墨汁后2 min和10 min分別從尾尖取血20 μL，并立即加到 2 mL 0.1%（w/v）的 Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液為空白對照，波長675 nm處測定吸光值。最后脫臼法處死小鼠、解剖并挑選出肝臟，脾臟分別稱重，按下列公式計算吞噬指數α。

式中：A1和A2分別為2 min和10 min尾尖取血測定的吸光值；t1為2 min，t2為10 min。

1.2.7 小鼠巨噬細胞溶菌酶活力的測定 小鼠頸椎脫臼處死后用生理鹽水沖洗出腹腔巨噬細胞，取1 mL沖洗液置于25 mL比色管中，用硫酸銨溶液補足至10 mL，之后操作與標準曲線制作相同，在波長281 nm下測定吸光值，從溶菌酶標準曲線上確定此吸光度對應的溶菌酶含量。

1.2.8 MTT法檢測Hela細胞生長抑制率（Kadowaki等，2013） 用提取純化后的多糖，設置5個不同的多糖濃度梯度 （25、50、100、200、400 μg/mL），測定不同濃度多糖對Hela細胞生長的影響。細胞培養在37℃、5%CO2條件下進行。

生長抑制率（IR）/%=[1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值]×100%。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，計量資料正態分布用表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用百分數表示，組間采用檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 16S rRNA的序列同源性比對結果及分析序列在NCBI上進行16S rDNA的序列同源性比對，采用phylogenetic Tree軟件對菌株的測序結果進行遺傳分析，分析結果見圖1。供試菌株DQ與Bacillus subtilis的親緣關系最近，同源性均達到99%。結合菌落形態及顯微觀察，鑒定為枯草芽孢桿菌（B.Subtilis DQ）。

圖1 芽孢桿菌的16SrDNA系統發育樹

2.2 胞外多糖對小鼠抗疲勞能力試驗結果 在整個給藥的過程中，試驗組小白鼠并沒有表現出身體的不良反應、各方面的反應遲鈍、拒食等明顯的中毒癥狀。然后在5 d后進行游泳抗疲勞試驗，小鼠在桶里游泳前期非常的活躍，但到后期不能上浮為已死亡的小白鼠，分別記錄每只小鼠死亡時間。由表1可知，給糖組小鼠游泳時間明顯高于對照組。

表1 胞外多糖對小鼠抗疲勞能力的影響

2.3 胞外多糖對小鼠免疫器官指數的作用結果由表2、3可知，胞外多糖組免疫器官指數顯著上升，表明枯草芽孢桿菌多糖可以顯著提高免疫器官的功能。

表2 胞外多糖對小鼠脾臟指數的影響

表3 胞外多糖對小鼠胸腺指數的影響

2.4 胞外多糖對小鼠體液免疫指數的作用結果通過測定小鼠IL-2濃度變化以研究其對體液免疫功能的作用，通過繪制標準曲線（見圖2）計算出樣品濃度，試驗結果見表4。

圖2 小鼠IL-2不同濃度下的吸光值

表4 胞外多糖對小鼠IL-2濃度的影響

由表4可知，試驗組與對照組相比，其IL-2指標的平均值顯著上升，通過單因素方差分析可知，P=0.013<0.05，即具顯著性，具有統計學意義。由此說明，枯草芽孢桿菌多糖對小鼠的體液免疫功能有一定的增強作用。

2.5 胞外多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的作用結果 小白鼠碳粒廓清試驗可衡量機體免疫功能，所反映的是巨噬細胞的吞噬功能。從表5中可以看出給藥組小鼠巨噬細胞吞噬活性顯著高于對照組，表明芽孢桿菌多糖具有增強機體巨噬細胞吞噬活性的潛在功能。該菌多糖能增強生物體內的非特異性免疫功能，這對提高機體的整個免疫功能意義重大。

表5 胞外多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響

2.6 胞外多糖對小鼠腹腔巨噬細胞溶菌酶活力的作用結果 溶菌酶廣泛存在于多種細胞內，通過水解致病菌中黏多糖而在免疫第二道防線中發揮重要作用，主要用于免疫和防御。因此溶菌酶活力的測定能很好地反映機體的免疫功能。從表6中可以看出給藥組顯著高于對照組，表明該多糖能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的溶菌酶活力，提高非特異性免疫功能。

表6 胞外多糖對小鼠巨噬細胞溶菌酶活力的影響

2.7 胞外多糖對腫瘤細胞生長的抑制作用 采用MTT法檢測多糖對Hela細胞生長代謝活力的影響，結果見圖3。多糖對Hela細胞的抑制具有時間和劑量效應，隨多糖濃度的升高和時間延長抑制率升高。 400 μg/mL多糖處理48 h后細胞生長抑制率最高可達到50.77%。可見此多糖具有體外抑制癌細胞生長與增殖的毒性，因此有望開發成一種新的抗腫瘤藥物。

圖3 多糖對Hela細胞生長抑制率柱形圖（24 h、48 h）

3 討論

大多細菌多糖是高復雜、多樣的結構，具有很多功能特性，許多微生物產生的胞外多糖吸附于微生物細胞表面或懸浮于培養液中，已被證實胞外多糖具有防御致病菌的作用，現在對抗癌、免疫活性以及在骨骼和組織再生方面的作用越來越受關注。

細菌胞外多糖作為天然產物，可大量發酵提取，且可降低成本，在國內外，不斷對植物、微生物等方面來源的多糖類物質進行開發和利用，但是對其分子機制還不很明確，有待進一步研究，多糖結構和活性之間的關系還有待進一步發掘（Jung 等，2015）。

枯草芽孢桿菌是一類非致病性革蘭氏桿菌，可在胞外形成莢膜，使其對外界不良環境具有抗性，主要由胞外多糖組成，細菌將其分泌至胞外，與環境營養因子有關（Stanislava等，2016）。 益生菌（如芽孢桿菌）在黏膜和系統水平可調節免疫應答，細菌胞外多糖是充當益生菌和宿主間免疫應答相互作用的媒介，此外，胞外多糖對可誘導巨噬細胞和淋巴細胞的免疫應答，巨噬細胞被認為可通過活化巨噬細胞扮演宿主防御和免疫調節活化免疫應答。他們是可以攻擊、破壞和攝入癌細胞、外源物質和傳染性細菌的一類特化巨噬細胞，胞外多糖對免疫細胞具有強有力的免疫激活作用歸因于其可增強一氧化氮和細胞因子的含量。然而，細菌胞外多糖有益的生物活性研究未受到充分重視，依然存在一些缺點，如研究和應用的速度較慢，沒有充分考慮各種類型胞外多糖具有的獨特生物活性等。目前，關于細菌胞外多糖的醫學生物活性研究，大多數都還處于體外試驗階段（Wang等，2015）。

本研究從家蠅體內篩選出一株枯草芽孢桿菌，發現其不僅具有很好的抗氧化作用，而且可以顯著提高小鼠免疫力和體外抗腫瘤細胞作用。家蠅具有較強的抗病能力可能與其共生益生菌有關，因而對此多糖的結構及免疫機理仍需進一步研究。

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