益生菌混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌生長以及產(chǎn)毒效果的影響

隋 明

（1.四川工商職業(yè)技術(shù)學院，四川都江堰 611830；2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610000）

黃曲霉毒素主要由曲霉屬真菌中黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長過程中產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在環(huán)境中的土壤、植物果實中，主要以發(fā)霉及污染的玉米和花生中含量較高，黃曲霉毒素對人和動物具有致畸、致癌、致突變作用（Zhou，2017；WU，2015）。黃曲霉毒素主要包括 B1、B2、G1等10多種，其中以黃曲霉毒素B1毒性最強，當食品和飼料中的黃曲霉毒素超標時，會引發(fā)人和動物發(fā)生急性中毒，給人和動物的健康造成嚴重的威脅（張煥，2017；劉曉玥，2017）。益生菌主要包括乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、尿腸球菌、雙歧桿菌等多種，這些不同類型的益生菌主要存在于人和動物體內(nèi)，這些不同類型的益生菌具有調(diào)整胃腸道內(nèi)菌群動態(tài)平衡，抑制腐敗菌生長，提高消化功能及免疫力作用（孫雯娟，2015）。許多研究表明，乳酸桿菌等多種益生菌對黃曲霉毒素B1有一定的吸附與抑制作用（吳珊，2016；尹勝利，2012）。目前關(guān)于富含硒乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌抑制黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒效果研究比較多，不同類型益生菌混合物對黃曲霉菌抑制作用研究較少。因此，本試驗研究了乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、尿腸球菌3種益生菌的混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒效果的影響，為進一步研發(fā)黃曲霉菌復合益生菌抑制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗菌株 枯草芽孢桿菌菌株、乳酸桿菌菌株、尿腸球菌菌株、產(chǎn)毒黃曲霉菌CGMCC3.4408標準菌株均由四川大學輕紡與食品學院實驗室保存。

1.2 試劑與儀器 MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、產(chǎn)毒培養(yǎng)基均購自北京奧星生物技術(shù)公司；AFB1檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學儀器有限公司生產(chǎn)；全波長酶標儀由德國Eppendour公司生產(chǎn)；常規(guī)試劑及儀器由本實驗室提供。

2 方法

2.1 不同類型的益生菌培養(yǎng)與計數(shù) 乳酸桿菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48 h，用MRS培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；枯草芽孢桿菌菌株復蘇后接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后，接種在MRS培養(yǎng)基中增殖3代后，進行計數(shù)，用MRS培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；尿腸球菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)14 h，連續(xù)增殖三代，用MRS液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；將乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和尿腸球菌均按照1∶1比例制成益生菌混合培養(yǎng)物。

2.2 黃曲霉菌孢子計數(shù) 黃曲霉菌CGMCC3.4408標準菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4～8 d后，再進行擴大培養(yǎng)的黃曲霉菌培養(yǎng)基，加入一定量的無菌的PBST緩沖液，將黃曲霉菌菌落洗下，收集到離心管中，用無菌的PBST洗滌3次后（8000 r/min離心5 min），再用無菌紗布過濾3次除去黃曲霉菌孢子的菌絲，進行計數(shù)。用無菌的PBST調(diào)整黃曲霉菌孢子濃度為1×108cfu/mL備用。

2.3 黃曲霉菌菌落生長抑制率測定 取乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)物、乳酸桿菌和尿腸球菌混合培養(yǎng)物各1 mL，分別涂布于PDA培養(yǎng)基上，空白對照組在PDA培養(yǎng)基上涂布乳酸桿菌，待完全被吸收后，在PDA培養(yǎng)基中心接種20 μL黃曲霉菌孢子懸液（1×108cfu/mL），28 ℃進行培養(yǎng)，分別在黃曲霉菌培養(yǎng)48、72、96 h后測量菌落大小。每種益生菌做10個重復，對10個重復結(jié)果的平均值進行統(tǒng)計，計算不同益生菌對霉菌生長的抑制率。

黃曲霉菌生長抑制率/%=（空白對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑）/空白對照組菌落直徑×100。

2.4 黃曲霉菌孢子生長抑制率測定 取5 mL的察氏培養(yǎng)基分別加入等量的乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)物、乳酸桿菌和尿腸球混合培養(yǎng)物，空白對照組加入等量的乳酸桿菌，分別接種500 μL的黃曲霉胞子孢液（1×108cfu/mL），每種益生菌做10個重復，28℃振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng) 6、18、24 h后取出每種益生菌培養(yǎng)液各0.1 mL均勻涂布于PDA平板，28℃培養(yǎng)4～8 d后，對黃曲霉菌孢子進行計數(shù)。黃曲霉菌孢子生長抑制率計算公式為：

抑制率/%=（空白對照組孢子數(shù)-試驗組孢子數(shù)）/空白對照組孢子數(shù)×100。

2.5 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測定 無菌的條件下，在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中均勻涂布2 mL甘油水溶液，待液體完全被吸收，分別接種黃曲霉菌孢子生長抑制率試驗中，將乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)物、乳酸桿菌和尿腸球混合培養(yǎng)物培養(yǎng)6、18、24 h后的培養(yǎng)液0.1 mL分別接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)15～20 d；空白對照組，將無菌的生理鹽水和黃曲霉胞子孢液（1×108cfu/mL）按照 1∶1 比例配合均勻后，取0.1 mL用同樣方法接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)15～20 d。試驗結(jié)束后提取黃曲霉菌，并按照AFB1檢測試劑盒進行測定其產(chǎn)毒量。霉菌產(chǎn)毒量抑制率/%=（空白對照組產(chǎn)毒量-試驗組產(chǎn)毒量）/空白對照組產(chǎn)毒量×100。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗結(jié)果以 “平均值±標準差”表示，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan’s法進行均值比較，以P＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃曲霉菌菌落生長抑制率測定結(jié)果 由表1可知，在培養(yǎng)48 h時，乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組黃曲霉菌菌落生長率均高于乳酸桿菌組，但是差異性不顯著（P ＞ 0.05）；在培養(yǎng) 72、96 h 時，乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組黃曲霉菌菌落生長率均高于乳酸桿菌組，分別提高了 27.1%、49.6%、42.1%、61.6%（P ＜0.05），乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組相比較差異性不顯著（P ＞ 0.05）。

3.2 黃曲霉菌孢子生長抑制率測定結(jié)果 由表2可知，在培養(yǎng)6、18、24 h時，乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組黃曲霉菌孢子的抑制率均高于乳酸菌組，差異性不顯著（P＞0.05），乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組與乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組相比，差異性顯著（P＜0.05），乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組與乳酸桿菌組相比，分別提高了35.4%、16.2%、21.1%。

表1 不同類型益生菌組黃曲霉菌菌落生長抑制率測定結(jié)果%

表2 不同類型益生菌組黃曲霉菌孢子生長抑制率測定結(jié)果%

3.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測定結(jié)果 由表3可知，在培養(yǎng)6 h時，乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組與乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率均高于乳酸菌組，差異性不顯著（P＞0.05），在培養(yǎng)18、24 h時，乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組與乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率均高于乳酸桿菌組，分別提高了24.5%、41.9%、55.2%、65.4%（P ＜ 0.05）， 乳酸桿菌和尿腸球菌混合物組與乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合物組之間相比差異性不顯著（P＞0.05）。

4 討論

表3 不同類型益生菌黃曲霉菌產(chǎn)毒量測定結(jié)果%

益生菌是一種活的微生物，主要存在于人和動物消化道內(nèi)，其中主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、尿腸球菌、酵母菌和霉菌等，被廣泛應用于人們食品和動物的飼料中（胡治銘，2016）。研究表明，益生菌具有改善人和動物體內(nèi)菌群的平衡、提高動物的飼料利用率、促進動物的生長及凈化養(yǎng)殖環(huán)境等多種優(yōu)點，被廣泛應用于畜禽的健康養(yǎng)殖中（Gold，2012）。動物的黃曲霉毒素中毒主要來源是飼料，在飼料生產(chǎn)中可能使用霉變飼料原料，當動物采食了霉變飼料，使動物呈現(xiàn)全身中毒的狀態(tài)，嚴重者可導致死亡（張煥，2017）。

目前，黃曲霉毒素清除方法主要包括物理方法、化學方法和生物去毒法，其中生物去毒法被廣泛應用（李莊悅，2017）。許多研究表明了益生菌對黃曲霉毒素具有一定吸附作用，其中乳酸桿菌研究比較多。Eraslan（2005）等研究表明，在黃曲霉菌培養(yǎng)過程中添加乳酸菌可以抑制黃曲霉菌生長。姚婉（2016）等報道，富硒乳酸菌對黃曲霉菌生長以及產(chǎn)毒具有很好抑制效果。枯草芽孢桿菌和屎腸球菌為動物腸道益生菌，這些益生菌可以合成或者分泌多種酶類物質(zhì)，這些酶類物質(zhì)不僅可以促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可以抑制腸道內(nèi)條件致病菌生長，并且以黏附抗性和競爭排斥限制有害菌體和毒素（吳珊，2016；胡治銘，2016）。國內(nèi)關(guān)于乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌及尿腸球菌混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒抑制鮮見報道。因此，本試驗將將乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、尿腸球菌活化后進行培養(yǎng)，調(diào)整濃度為1×108cfu/mL，將乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌和尿腸球菌均按照1∶1比例制成益生菌混合培養(yǎng)物，并以乳酸桿菌作為對照，進一步探討混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒影響。結(jié)果顯示，乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)物組黃曲霉菌菌落生長抑制率、黃曲霉菌孢子生長抑制率及黃曲霉產(chǎn)毒量均高于乳酸桿菌組，差異性顯著（P＜0.05），因此，證實了乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)物對黃曲霉菌具有很好的抑制作用，并且兩種益生菌具有協(xié)同作用。可能由于枯草芽孢分泌的多種活性化學物質(zhì)，可抑制黃曲霉菌的生長，分解黃曲霉菌所產(chǎn)生的毒素，因而提高了對黃曲霉菌菌落和生長抑制率及產(chǎn)毒量抑制率。本試驗為食品及飼料中黃曲霉菌有效防控提供依據(jù)。

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