1株產高溫纖維素酶細菌的分離及Biolog鑒定

趙 旭，王文麗，李 娟

（甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所，甘肅 蘭州 730070）

纖維素是綠色植物細胞壁的主要成分，是綠色植物通過光合作用形成的物質，為地球上含量最大的碳水化合物［1］。然而由于纖維素降解速度緩慢，并且難溶于水，所以目前對纖維素的開發利用效率還非常低。我國纖維素類資源豐富，農業生產中每年都產生數量非常巨大的作物秸稈和皮殼［2］，然而目前處理這些農業廢棄物最主要的方法是將其在原地焚燒，這種方法雖然省時省力，但原地焚燒秸稈不僅沒有充分利用秸稈給農民帶來應有的經濟效益，而且還嚴重污染了環境，加速了環境的惡化［3］。理化降解纖維素的方法因降解成本高，容易污染環境而使用較少。無污染、綠色環保分解利用纖維素的有效途徑之一是利用纖維素酶的水解作用將其分解成小分子的有機物，并用這些有機物被用來合成多種為我們能利用的有益物質。纖維素酶（Cellulase）是一類能夠降解纖維素生成葡萄糖等小分子有機物的酶的總稱，主要由真菌、放線菌、細菌等微生物產生，原生動物、軟體動物、昆蟲等在一定的條件下也可以產纖維素酶［4］。研究發現，真菌產生的纖維素酶活性較高，但其對纖維素的降解作用比較劇烈，會降低產品的質量。與真菌相比，細菌產生的纖維素酶對纖維素的降解要溫和的多，而且降解過程的可控性強，因此細菌產生的纖維素酶在工業生產中具有廣闊的應用前景［5-6］。Biolog微生物鑒定系統是通過分析菌株對GenIII 微孔板上71種碳源的利用情況和23種化學物質的敏感性來鑒定菌株的設備，GenIII 微孔板上的四唑類氧化還原染料顏色變化強弱代表微生物對碳源的利用程度和對化學物質的敏感程度［7-8］。我們采用Biolog GEN III微孔板對從高溫蘑菇培養料中分離篩選出的1株纖維素降解菌細菌進行了生理生化分析及鑒定，以期為高溫纖維素降解細菌的進一步研究應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品取自甘肅省永昌縣新城子鎮的腐熟雙孢菇培養料。

1.2 試劑

供試試劑CMC-Na、剛果紅、蛋白胨、酵母膏均購自國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 培養基

1.3.1 富集培養基 CMC-Na 10.0 g、蛋白胨1.0 g、 K2HPO42.0 g、（NH4）2SO41.0 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、定容至1 000 mL、121 ℃滅菌30 min。

1.3.2 篩選培養基 CMC-Na 10.0 g、蛋白胨 1.0 g、K2HPO40.5 g、 KH2PO40.5 g、 （NH4）2SO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 NaNO36.0 g、 瓊脂 15.0 g、 pH 7.0、 水 1 000 mL、121 ℃滅菌 30 min。

1.3.3 發酵培養基 CMC-Na 10.0 g、蛋白胨1.0 g、K2HPO40.5 g、 KH2PO40.5 g、 （NH4）2SO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 NaNO36.0 g、 瓊脂 15.0 g、 pH 7.0、 水 1 000 mL、121 ℃滅菌 30 min。

1.4 菌株的分離純化

1.4.1 富集 稱取10 g樣品加入250 mL 的三角瓶中（裝有玻璃珠和90 mL富集培養基），在50 ℃、150 r/min搖床中每培養72 h傳代1次。傳代2次后涂布平板分離。

1.4.2 分離 采用梯度稀釋涂平板法。吸取富集培養液1 mL，接入9 mL生理鹽水中，獲得10-1的菌懸液，按以上方法依次稀釋得到10-2、10-3、10-4…10-8的菌懸液，選取梯度10-4～10-8的菌懸液，分別吸取100 μL涂布于纖維素培養基平板，50 ℃下培養72 h。通過平板涂布分離，共獲得15株50 ℃下可以在CMC平板上生長的菌株，分別命名為 X1～X15。

1.4.3 純化 待平板上長出菌落后，將平板培養基上的單個菌落挑取并劃線接種到纖維素培養基上，50 ℃培養72 h。待長出菌落后，連續將單個菌落在纖維素平板培養基上劃線培養3次，直到沒有雜菌為止。

1.5 菌株的培養和初篩

將初步分離純化到的所有菌株接種到纖維素平板培養基上，50 ℃下培養72 h。待長出菌落后，用質量濃度為1 mg/L的剛果紅染色30 min，然后用1 mol/L的NaCl 溶液浸泡洗脫30 min，傾去洗液，觀察菌落有無透明圈，并測定透明圈直徑。CMC 酶相對活性［9］（A）計算公式如下：

A = 溶解圈直徑（cm）/ 菌體培養時間（d）。

1.6 菌株羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測定

CMC酶活力測定參照DNS 法［10］。 取2.0 mL質量分數為1%的CMC-Na 溶液（用0.05 mol/L pH 4.8 的檸檬酸緩沖液配制） 加入到10.0 mL的具塞試管中，然后加入0.5 mL 粗酶液并搖勻，60 ℃水浴30 min取出，加入3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫，定容至10 mL。最后在540 nm波長下測定吸光值，以空白作為對照調零。通過標準曲線計算出還原糖的含量。酶活力單位定義為每mL酶液在1 min內催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量，即1 U/mL。

1.7 菌株的Biolog鑒定

1.7.1 材料 Biolog GEN III微孔板（MicroPlate）、濁度儀、8通道電動移液器、BUG 瓊脂、O mniLog系統以及GN、GP數據庫。

1.7.2 方法 將篩選獲得的菌株在培養基（BUG+B）上33 ℃下培養24 h，用無菌棉簽挑取少量菌落，將專用接種液制備為均一菌懸液，與標準菌懸液進行濁度對比。首先調節菌懸液濃度至90%～98% T，然后將調好濃度的菌懸液移入到V型加樣槽中，再用8通道電動移液器將菌懸液按順序加入GEN III微孔板的所有孔中（每孔加入量為100 μL），最后將加好菌懸液的GEN III微孔板放入培養箱33 ℃培養。依次在培養4、8、12、16、24 h時用OmniLog讀數儀讀取數據，并通過與數據庫比較獲得鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離及初篩

通過剛果紅對菌株進行初篩的結果（圖1）可以看出，15株菌中共選出6株具有透明圈，且CMC酶相對活性較大的菌株，其中菌株X3的剛果紅染色透明圈最大，CMC 酶相對活性最高。

圖1 菌株CMC酶相對活性比較

2.2 選出菌株羧甲基纖維素酶（CMCase）活性比較

為了進一步驗證初篩出菌株的產酶能力，對初篩選出的菌株進行液體發酵培養，測定羧甲基纖維素酶（CMCase）活性結果（圖2）。 菌株 X3的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性最高，菌株X1的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性最低。菌株X3在50 ℃培養條件下培養72 h后，粗酶液的羧甲基纖維素酶（CMCase）活力達20.36 U/mL。選出的6株纖維素菌中菌株X3和X11的酶活性較高，比菌株X2、X6、X8的CMCase高出60%以上；菌株X1的CMCase活性僅為2.97 U/mL。

圖2 菌株CMCase活性比較

2.3 菌株X3GEN III微孔板的鑒定及分析

菌株X3在GEN III 微孔板上的顯色變化（圖3）所示，菌株X3的陽性反應為25個，陰性反應為39個，處于“邊界值”的反應為32個。碳源利用測試的陽性反應有15個，陰性反應有30個，說明菌株X3能利用D-蜜二糖等25種碳源。化學敏感性測試的陽性反應有10個，陰性反應有9個。

圖3 X3在GEN III鑒定板上的反應

2.4 選出菌株的Biolog鑒定

接有 X3菌懸液的 GenIII 微孔板 33 ℃培養16～24 h，經Biology微生物鑒定系統鑒定得到的結果如表1所示。Biolog的菌株鑒定結果包括可能性（PROB）、 相似性（SIM）和位距（DIST）3 個參數，其中SIM值代表與數據庫相應菌株數據的相似度。如果SIM 值≥0.50，則認為系統確定的種屬鑒定結果可信。SIM 值越接近1.00，可信度就越高。如果SIM值<0.50，而鑒定結果中所有屬名相同的SIM值之和又大于0.5，則可將結果認定為鑒定菌株的屬名［11-12］。 菌株X3與芽孢桿菌（Bacillus vallismortis /subtilis） 相似度值為0.660，大于臨界值0.50，遺傳距離為4.875≤5.00，所以鑒定結果為芽孢桿菌（Bacillus vallismortis/subtilis）。芽孢桿菌（Bacillus vallismortis/subtilis）是細菌中的一個科，能形成芽孢（內生孢子），對外界有害因子的抵抗力很強，廣泛分布于土壤、水、空氣以及動物腸道等處。目前，研究芽孢桿菌產高溫纖維素酶及應用的報道較少。

表1 菌株X3Biolog鑒定結果

3 結論討論

本研究利用剛果紅透明圈鑒別法從蘑菇培養料中分離篩選出1株產纖維素的菌株X3。該菌株在培養基初始pH為7.0、培養溫度為50 ℃、接種量為2%、搖床轉速為200 r/min的條件下培養72 h，CMCase活力達到20.36 U/mL。利用Biolog鑒定系統將菌株X3初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus vallismortis/subtilis）。

產纖維素酶的微生物種類繁多。多年來，國內外學者對產纖維素酶微生物進行了大量的分離篩選工作，形成了完善可靠的分離篩選方法［13］。目前較為常用的主要有剛果紅透明圈鑒別法和濾紙條崩潰法兩種［14］。有學者從溫泉水和堆肥中分離篩選出嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）［15-16］， 該菌產生的纖維素酶活最適溫度高于60 ℃，并且熱穩定性很好。芽孢桿菌是一類可以在惡劣生長環境中生長的細菌，在生長環境惡劣它形成芽孢以抵抗惡劣環境對細胞的危害。芽孢桿菌可以在酸堿、高溫的環境中生存，從而放寬了芽孢桿菌菌劑的生產和儲存條件，有利于菌劑的大規模生產和儲存［17］。雖然Biolog 微生物鑒定系統常被用于鑒定純培養的革蘭氏陰性和陽性細菌，但Biolog 微生物鑒定系統具有局限性，就是它僅能對數據庫內已有的菌種進行鑒定，而數據庫以外的菌種就得不到鑒定結果［18-19］。影響Biolog 微生物鑒定系統鑒定結果的因素很多，如微生物培養液的純度、數量、活性、培養時間、培養溫度等都會影響鑒定結果。16S rDNA鑒定方法是在屬水平上對細菌進行鑒定的方法，如果要將細菌鑒定到種，還需要借助生理生化的方法。Biolog微生物鑒定系統不僅可以將菌株鑒定到種水平，而且減化了操作步驟，節省了工作時間［20］。相信隨著Biolog微生物鑒定系統數據庫的不斷補充和培養條件的優化，其鑒定結果也將會更加準確，將在微生物的鑒定工作中發揮非常重要的作用。

［1］金 嫘，王 晶，李新華.Alcalase堿性蛋白酶酶解蛋清制備抗氧化活性肽［J］.食品研究與開發，2009（6）： 59-62.

［2］楊 盛，侯紅萍.纖維素酶及其研究進展［J］.中國調味品， 2008（11）： 27-30.

［3］劉建國，韓 梅.一株低溫產纖維素酶細菌的篩選及其發酵產酶條件的優化［J］.食品與發酵科技，2014，50（1）： 38-41.

［4］錢文佳，闞光鋒，徐 仲，等.產低溫纖維素酶南極細菌的篩選［J］. 食品科技， 2010， 35（1）： 15-18.

［5］ITO S.Alkaline celluloses from alkalophilic Bacillus：enzymatic properties， genetics and application to detergents［J］.Extremophiles， 1997（1）： 61-66.

［6］劉 剛，余少文，孔 舒，等.堿性纖維素酶及其應用的研究進展［J］.生物加工過程，2005（2）：9-14.

［7］BOCHNER B R.Sleuthing out bacterial identities［J］.Nature， 1989， 339： 157-158.

［8］BOCHNER B R.“Breathprints”at the microbial level［J］.ASM News， 1989， 55： 536-539.

［9］史玉英，沈其榮，婁無忌，等.纖維素分解菌群的分離和篩選［J］. 南京農業大學學報， 1996， 19（3）： 59-62.

［10］MILLER G H.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal.Chem.，1959（31）： 426-428.

［11］曾哲靈，羅敏，梁麗軍.Biolog微生物自動分析系統在乳桿菌鑒定中的應用［J］.南昌大學學報（理科版），2008， 32（4）：385-393.

［12］劉 鵬，魏亞東，崔鐵軍.Biolog系統和16SrDNA序列分析方法在植物病原細菌鑒定中的應用［J］.植物檢疫，2006， 20（2）： 86-87.

［13］李路軍，游銀偉，任鵬飛，等.一株具有纖維素降解能力的鏈霉菌LLJ-03的鑒定及初步研究［J］.西南農業學報， 2010， 23（4）： 1253-1256.

［14］付麗麗.作物秸稈纖維素降解菌的分離與篩選［D］.杭州：浙江大學，2012.

［15］熊世勤，彭 謙，隴 猷，等.耐熱纖維素酶產生菌及產酶條件［J］. 云南大學學報， 1999， 20（2）： 91-94.

［16］賀 云.產胞外耐高溫纖維素酶細菌的獲得和酶的純化及性質研究［J］.常州工學院學報，2006（1）：14-16.

［17］張立靜，李術娜，朱寶成.高效纖維素降解菌短小芽孢桿菌T-7的篩選、鑒定及降解能力的研究［J］.中國農學通報， 2011， 27（7）： 112-118.

［18］WILSON W J， DILLARD H R， DEER S V.Assessment of phenotypic variability in Erwinia stewarii based on metabolic profies［J］.Plant Disease， 1999， 83（2）：114-118.

［19］JONES J B， CHASE A R， HARRIS G K.Evaluation of the Biolog GN microplate system for identification of some plant pathogenic bacteria［J］.Plant Disease， 1993，77（6）： 553-558.

［20］TANG Y W， ELLIS N M， HOPKINS M K， et al.Comparison of phenotypic and genotypic techniques for identification of unusual aerobic pathogenic gram-negative bacilli［J］.Journal of Clinical Microbiology，1998，36（12）： 3674-3679.