姜黃素-PLGA納米粒對RG2大鼠神經膠質瘤模型的影響

周春輝，郭寶瑞，胡晨浩，張劍寧*

0 引言

姜黃素是姜黃的活性成分，對多種癌癥[包括膠質母細胞瘤(GBM)]有顯著的抗腫瘤作用，但姜黃素吸收差，生物利用度低。另外，膠質母細胞瘤化療失敗的主要原因之一是血腦屏障，為了克服這一障礙，需要高劑量使用抗腫瘤藥物，導致毒副作用增強。因此，對膠質母細胞瘤更有效、更安全的治療需要穿越血腦屏障，靶向腫瘤，這可以通過藥物遞送系統來實現[1-2]。

納米結構脂質載體是一種作為姜黃素遞送系統的前景性藥物[3]。體外研究證明，載姜黃素的納米粒和納米纖維對C6和9L神經膠質瘤細胞具有劑量依賴性的細胞毒副反應[4]。在結腸癌、宮頸癌和前列腺癌中，已顯示出載姜黃素PLGA的功效[5]。在此基礎上，本文旨在評估腫瘤內或靜脈內施用載姜黃素PLGA-DSPE-PEG納米粒對大鼠神經膠質瘤(RG2)腫瘤模型的抗腫瘤功效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 姜黃素、乙腈(均為阿拉丁試劑)，DSPE-PEG、卵磷脂(購自Lipid公司)；醫用PLGA(長春圣博瑪生物材料有限公司)。

高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國Agilent公司)，包括紫外(UV)檢測器(425 nm)和色譜柱(ODS2 C18200 mm×4.6 mm)；超聲波水浴儀(Branson B 220 Smith Kline，美國)；Malvern Zetasizer Nano系列ZS裝置。

48只成年雌性Wistar大鼠，體重250～300 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供,實驗動物合格證編號：SCXK(滬)2012-0002。

1.2 姜黃素含量測定 根據Wichitnithad等[6]報道的方法，通過高效液相色譜(HPLC)分析姜黃素的含量。使用配有紫外(UV)檢測器(425 nm)和色譜柱(ODS2 C18200 mm×4.6 mm)的Agilent HPLC系統(Agilent 1100，美國)。流動相包括乙腈和2% v/v乙酸(40∶60，v/v)，流速為2.0 mL/min。色譜法通過線性、靈敏度、精密度、準確度和特異性驗證。

1.3 Cur-NP的制備 在混合納米粒的制備中，使用PLGA和1,2-二硬脂酰基-甘氨酰-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(PEG)-2000](DSPE-PEG)作為共聚物(銨鹽)。通過超聲乳化法制備PLGA-DSPE-PEG雜化納米粒子[7]。將PLGA(共聚物比為85∶15)溶于乙腈(2.5 μg/ml)中，獲得有機相。在有機相制備過程中，加入姜黃素[姜黃素/PLGA(w/w)=20%]。將卵磷脂和DSPE-PEG分別溶解在4% (v/v)乙醇中，然后與去離子水混合獲得水相。將水相加入到有機相(比例為10∶1)中，并使用超聲波水浴儀(Branson B 220 Smith Kline，美國)在頻率42 kHz和功率100 W下，在玻璃小瓶中超聲處理5 min。將納米粒在10 kDa分子尺寸可滲透膜(微孔，10 kDa)的過濾離心管中離心，并使用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)洗滌3次。將獲得的納米粒分散體在-80 ℃下冷凍干燥24 h。

1.4 納米粒的表征 通過Malvern Zetasizer Nano系列ZS裝置測量納米粒的粒徑。通過HPLC法測定藥物包載量。通過破壞有機溶劑的納米粒結構，將乙腈加入納米粒中以提取藥物。將溶液通過0.2 μm膜過濾器過濾并注入HPLC柱。采用透析法測定姜黃素的體外釋放行為[8]。將納米粒分散于PBS中并置于2 000 Da孔徑的透析袋內，將該透析袋置于37 ℃的磁力攪拌器(100 r/min)攪拌的水浴中。以預定的時間間隔，采用HPLC法對整個釋放基質進行提取與分析。

1.5 體外實驗 將含5×103細胞的RG2細胞懸浮液100 μl加入96孔平底板中。將細胞在培養箱中保持過夜以使其附著于孔。第2天用姜黃素溶液(12.5、25、50、100、200 μmol/L)處理細胞并孵育72 h。用WST-1 [5-(2,4-二磺基苯基)-2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-2H-四唑內鹽]測試進行細胞活力檢測。

1.6 動物研究 研究列入48只成年雌性Wistar大鼠(250～300 g)。將動物飼養于標準動物房中，并在給藥前給予0.05 mg環孢菌素5 d。

腦腫瘤的誘導方法：使用Yemisci等[9]和Geletneky等[10]的改良方法。經腹膜內施用氯胺酮(80 mg/kg)和木霉素(10 mg/kg)混合物麻醉后，將50×104個RG2細胞/5 μl細胞注射到大鼠腦中。為獲得所需數量的RG2細胞，將RG2細胞懸浮液加入到DMEM培養液中，于2 000 r/min離心5 min，細胞在顯微鏡下計數。

RG2細胞的注入方法：將大鼠置于立體定位儀(圖1A、圖1B)中。將頭皮剃光，將含有50×104RG2細胞的5 μl細胞懸液用Hamilton玻璃注射器單側注射到右前紋狀體，坐標為前后-0.5 mm，側面+3.0 mm，腹側-6 mm。手術中，通過直腸探針連續監測體溫，并用恒溫盤保持在(37.0±1) ℃。RG2細胞植入后，對大鼠進行日常活動和全身健康隨訪，處死對環境無興趣、對外部刺激無反應、不進行自體喂養且紅眼的大鼠。

圖1將RG2細胞注入右側紋狀體前后-0.5mm，側面+3.0mm，腹側-6mm

注：A.RG2細胞注射后大鼠腦的冠狀切片；B.立體定位儀定位；C.3 Tesla MR單元的大鼠成像，開發直徑3.5 cm 圓形環元件的手工制造的8通道僅接收相位陣列表面線圈；D.腦腫瘤的出現和頭尾向的冠狀面MR圖像體積的測量(高度)和從左到右長度的測量(橫向)

模型驗證：在腫瘤細胞植入后10 d，通過磁共振成像(MR)評估腦腫瘤的存在和大小。MR成像測量腫瘤大小后，腦腫瘤體積15～30 mm2的大鼠納入研究組。在MR成像同一天，將藥物溶液或制劑注射到靜脈注射組大鼠的尾靜脈中，和與腫瘤內治療組細胞著床的同一坐標的腦內。腫瘤內和靜脈內注入的藥液體積或納米粒分散體積[在含有Tween-20(0.1%，w/v)的PBS中制備]均為大鼠腫瘤耐受量(20 μl)。注射前該制劑在UV光下滅菌30 min[11]。

實驗分組：將大鼠隨機分為7組，每組6只：①未經處理(對照組)；②經瘤內空白納米粒處理(不含姜黃素)；③靜脈注射空白納米粒(不含姜黃素)；④瘤內姜黃素處理(25 μmol/L)；⑤用姜黃素靜脈注射(25 μmol/L姜黃素溶液，不含納米粒)處理；⑥用包含25 μmol/L姜黃素的Cur-NP負載瘤內處理；⑦用姜黃素瘤內注射(25 μmol/L姜黃素溶液)用包含25 μmol/L姜黃素的靜脈內Cur-NP處理(表1)。

表1 研究分組

注：NP：納米粒，CC：姜黃素；it：腫瘤內，iv：靜脈注射

2 結果

Cur-NP的粒徑為(169±4.8)nm，多分散性指數(PI)為0.22，該藥物包封率為35%±1.2%。體外藥物釋放研究表明姜黃素的釋放在168 h結束(圖2)。

2.1 腦腫瘤的影像學和病理學 在48只實驗小鼠中，經RG2細胞注射10 d后，42只大鼠出現了腦腫瘤，并對其進行了靜脈內或腫瘤內注射。MR成像顯示腫瘤粗糙，T2高信號，伴有壓迫和疝出現，根據其大小而定。對大腦的宏觀檢測中，我們在RG2細胞注射部位觀察到灰色占位性病變。顯微鏡下，腫瘤細胞呈多形性核團，膠質母細胞瘤的出血、壞死和微血管增生特征明顯。腫瘤完全由腫瘤細胞組成，無炎癥反應(圖3)。對照組(組1)4只小鼠在第2次MR成像前死亡，可能原因是增加的顱內壓和腦疝。

2.2 治療對腫瘤大小和病理的影響 根據兩者治療后的MR成像和病理測量腫瘤大小，

圖2姜黃素HPLC色譜圖、標準曲線及姜黃素-PLGA-DSPE-PEG雜化納米粒的體外藥物釋放曲線(n=3)

圖3瘤內注射載Cur-NP前后蘇木精-伊紅染色的大鼠腦腫瘤組織病理學圖像

注：藥物注射前(A、B、C)可見微血管增生(A，40×)，假柵欄狀壞死和多形性(B，100×)和致密腫瘤細胞(C，400×)；瘤內注射載Cur-NP后(D、E、F)，可見血管增生減少(D，40×)和假柵欄狀壞死和多形性減少(E，100×)。在400×放大倍數下觀察到巨核細胞和含鐵血黃素巨噬細胞(F)治療前僅由MR成像確定。5 d后瘤內注射Cur-NP組腫瘤體積減小(P=0.028)，而在未治療對照組腫瘤體積增大(P=0.036)，而其他組治療前后差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明，只有瘤內注射Cur-NP才能使腫瘤體積減小。見表2。

表2 研究組治療前后的腫瘤體積(mm3)

注：*Wilcoxon符號秩檢驗

腫瘤大小百分比變化比較見表3。結果顯示，靜脈內Cur-NP組(第3組)或靜脈內Cur-NP組(第7組)的腫瘤體積變化率與對照組比較差異無統計學意義(P=0.095或P=0.381)，其腫瘤體積增加并無顯著差異。結合表2和表3的結果，可見注射姜黃素組(第4組)或瘤內Cur-NP組(第6組)比其他組有更好的抗腫瘤作用，表明只有腫瘤內應用姜黃素具有抗腫瘤的作用。此外，負載姜黃素的納米粒子瘤內注射，與單用姜黃素比較，能更著地減小腦腫瘤體積。

3 討論

姜黃素是一種對神經膠質細胞具有抗腫瘤活性的植物化學成分，其作用包含各種機制，如誘導細胞凋亡或自噬，上調雙特異性磷酸酶-2，抑制細胞外信號調節激酶和c-Jun N端激酶，下調細胞增殖及端粒酶有關的基因活性。已有姜黃素對神經膠質細胞的抗腫瘤活性的報道[12-13]。姜黃素與化療藥物聯合應用是預防和治療腫瘤研究的熱點之一，在臨床化療中具有抗癌、逆轉耐藥及減毒的多重作用[14]，有助于提高化療療效，已有多項臨床試驗表明，姜黃素對多種癌癥有顯著的抗腫瘤作用[15-18]。但姜黃素穩定性和溶解性低，其臨床試驗療效報道也曾出現無效結論。因此，通過納米遞送系統解決姜黃素的穩定性、溶解性低的問題，對于姜黃素的應用具有重要意義，尤其是在治療腦腫瘤方面，納米粒子療法比傳統療法更有優勢，可通過血腦屏障和增加藥物在靶組織的濃度[19]。

為了利用藥物輸送系統，提高姜黃素的穩定性和生物利用度，降低藥物的毒性，我們使用了PLGA和DSPE-PEG制備雜化納米粒子來包載姜黃素。本研究用RG2細胞來誘導小鼠中的膠質母細胞瘤，與常用的其他模型相比，RG2模型具有非免疫原性的優點[20]。對在小鼠腦腫瘤模型中腫瘤微觀結構和抗腫瘤藥物的反應研究，通常用組織病理學進行評估。本研究中，除組織病理學評估外，還應用磁共振成像來測量腫瘤面積。鑒于MR成像和病理腫瘤測量的一致性，在小鼠不被處死的前提下，MR成像可以用來監測治療大鼠腦內的腫瘤。

本研究中，對照組的腫瘤大小在5 d后顯著增加。在應用于靜脈內的空的或負載姜黃素的納米粒子組中，腫瘤仍然在增長，表明靜脈給藥組通過血腦屏障的藥物不足。然而，雖然靜脈注射姜黃素不能引起腫瘤大小的減少，但存在限制腫瘤生長的趨勢。同樣，空納米粒瘤內注射阻止腫瘤生長。由瘤內注射造成的損傷和局部炎癥可能是瘤內給藥抑制腫瘤生長納米粒子引起的[21]。CurNP瘤內注射在膠質母細胞瘤上具有顯著的抗腫瘤活性。納米粒裝載有抗腫瘤藥物的瘤內注射，作為腦腫瘤組織給藥方法，值得深入研究。

表3 研究組腫瘤體積變化百分比和組間統計學比較

注：*Mann Whitney U檢驗

本研究的主要局限是實驗動物研究樣本量較小。另一個問題是缺乏T1加權后的MR成像。然而，因為腫瘤并不總是以釓為基礎的造影劑顯示增強[22]，T2加權影像學及病理切片顯示腫瘤區域非常相似，因此，缺乏T1加權成像在本研究中不是一個主要限制。總之，包載姜黃素的PLGA-DSPE-PEG雜化納米粒子瘤內應用顯著減少腫瘤的大小，進一步研究還需要對PLGA-DSPE-PEG納米粒子的工藝進行優化以適合放大生產，以及體內外對PLGA-DSPE-PEG納米粒子進行系統性毒性和機制評價。

參考文獻：

[1] 張立康,汪小珍,李婉姝,等.姜黃素在大鼠體內藥代動力學和生物利用度研究[J].中國藥理學通報,2011,27(10):1458-1462.

[2] 李晴宇,葉曉莉,陳玲,等.姜黃素PLGA納米粒的制備及制劑學性質分析[J].實用藥物與臨床,2016,19(6):753-757.

[3] Madane RG,Mahajan HS.Curcumin-loaded nanostructured lipid carriers (NLCs) for nasal administration:design,characterization,andinvivostudy[J].Drug Deliv,2016,23(4):1326-1334.

[4] Guo G,Fu S,Zhou L,et al.Preparation of curcumin loaded poly(ε-caprolactone)-poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone) nanofibers and their in vitro antitumor activity against Glioma 9L cells[J].Nanoscale,2011,3(9):3825-3832.

[5] Yallapu MM,Khan S,Maher DM,et al.Anti-cancer activity of curcumin loaded nanoparticles in prostate cancer[J].Biomaterials,2014,35(30):8635-8648.

[6] Wichitnithad W,Jongaroonngamsang N,Pummangura S,et al.A simple isocratic HPLC method for the simultaneous determination of curcuminoids in commercial turmeric extracts[J].Phytochem Anal,2009,20(4):314-319.

[7] Fang RH,Aryal S,Hu CM,et al.Quick synthesis of lipid-polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method[J].Langmuir,2010,26(22):16958-16962.

[8] Wang S,Su R,Nie S,et al.Application of nanotechnology in improving bioavailability and bioactivity of diet-derived phytochemicals[J].J Nutr Biochem,2014,25(4):363-376.

[9] Yemisci M,Bozdag S,Cetin M,et al.Treatment of malignant gliomas with mitoxantrone-loaded poly (lactide-co-glycolide) microspheres[J].Neurosurgery,2006,59(6):1296-1302.

[10]Geletneky K,Kiprianova I,Ayache A,et al.Regression of advanced rat and human gliomas by local or systemic treatment with oncolytic parvovirus H-1 in rat models[J].Neuro Oncol,2010,12(8):804-814.

[11]Chenevert TL,McKeever PE,Ross BD.Monitoring early response of experimental brain tumors to therapy using diffusion magnetic resonance imaging[J].Clin Cancer Res,1997,3(9):1457-1466.

[12]Ramachandran C,Lollett IV,Escalon E,et al.Anticancer potential and mechanism of action of mango ginger (Curcuma amada Roxb.) supercritical CO extract in human glioblastoma cells[J].J Evid Based Complementary Altern Med,2015,20(2):109-119.

[13]趙心宇,孟秀香,賈莉,等.姜黃素抗腫瘤機制[J].實用藥物與臨床,2006,9(1):51-52.

[14]王亞華,應雪,張春春,等.替莫唑胺聯合姜黃素對C6膠質瘤細胞凋亡的作用[J].實用醫學雜志,2016,32(10):1564-1567.

[15]Kunnumakkara AB,Bordoloi D,Harsha C,et al.Curcumin mediates anticancer effects by modulating multiple cell signaling pathways[J].Clin Sci (Lond),2017,131(15):1781-1799.

[16]Gupta SC,Patchva S,Aggarwal BB.Therapeutic roles of curcumin:lessons learned from clinical trials[J].AAPS J,2013,15(1):195-218.

[17]張朋飛,孫劍經,劉華,等.姜黃素對人食管癌耐藥細胞Eca-109/VCR生長和凋亡的影響[J].實用醫學雜志,2017,33(13):2083-2087.

[18]余俊青,姚廣裕,胡曉磊,等.姜黃素通過降低MT1-MMP表達抑制乳腺癌細胞的增殖與侵襲[J].實用醫學雜志,2017,33(9):1394-1396.

[19]Karim R,Palazzo C,Evrard B,et al.Nanocarriers for the treatment of glioblastoma multiforme:current state-of-the-art[J].J Control Release,2016,227:23-37.

[20]Barth RF,Kaur B.Rat brain tumor models in experimental neuro-oncology:the C6,9L,T9,RG2,F98,BT4C,RT-2 and CNS-1 gliomas[J].J Neurooncol,2009,94(3):299-312.

[21]Thomas AA,Ernstoff MS,Fadul CE.Immunotherapy for the treatment of glioblastoma[J].Cancer J,2012,18(1):59-68.

[22]Hammoud MA,Sawaya R,Shi W,et al.Prognostic significance of preoperative MRI scans in glioblastoma multiforme[J].J Neurooncol,1996,27(1):65-73.