血竭素高氯酸鹽對阿爾茨海默病大鼠學習記憶及海馬TGF-β1通路相關蛋白的影響

張路贏，馬丹霞，楊艾堂，彭會明

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見的中樞性神經系統退行性疾病，是一種由多基因和多因素影響的神經性疾病，但具體的發病機制尚未完全明確[1]。AD患者主要表現為認知功能障礙、語言障礙、記憶障礙和人格改變等，嚴重影響患者的社交和生活質量[2]，因此，探究有效治療AD的藥物是神經內科醫生研究的重點。血竭素是從血竭中提取的，其主要有效成分是黃酮類物質[3]，具有抗菌消炎、活血生肌、收斂止血的功效[4]，近年來研究表明，炎癥反應在AD的發生、發展中起重要作用[5]，而且血竭素高氯酸鹽對AD的療效尚未見報道。本研究以阿爾茨海默病模型大鼠為研究對象，探究血竭素高氯酸鹽對模型大鼠學習記憶及海馬轉化生長因子β1(TGF-β1)通路相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼料 健康雄性SD大鼠70只，SPF級，6～8周齡，體重(150±20)g，購自北京生命科學研究所，許可證號：SYXK(京)2015-0002。

1.1.2 主要材料與儀器 血竭素高氯酸鹽(純度為99.2%)購自中國藥品生物制品檢定所；多奈哌齊(國藥準字H20050978)購自衛材(中國)藥業有限公司；TRIzol reagent購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自寶生物(大連)有限公司；TaqDNA聚合酶購自英國NEB公司；兔抗鼠Aβ、TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司；超凈臺購自上海蘇凈實業有限公司；引物序列由深圳華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 阿爾茨海默病動物模型建立 隨機選取10只大鼠作為假手術組，其余大鼠按照文獻資料構建AD模型[6]，具體操作如下，將大鼠稱重，腹腔注射4%水合氯醛進行麻醉，頭部剪毛消毒，將大鼠固定于腦立體定位儀上，于頭皮正中切開，剝離右側顱頂骨膜，用顱骨鉆刺一2 mm的骨窗，剝開硬腦膜，用微量注射器向大鼠大腦海馬區注入5 μl Aβ1-42磷酸鹽溶液(注射速度1 μl/min)；假手術組以相同方法注射等量磷酸緩沖液，手術后均用牙科水泥固定骨孔處，干燥后縫合頭皮，給大鼠腹腔注射120 000 U/kg，將大鼠回籠飼養48 h(排除手術和麻醉干擾)。

1.2.2 動物分組 將造模成功的大鼠隨機分成5組，每組10只，分別命名為模型組、多奈哌齊組、DP低劑量組、DP中劑量組、DP高劑量組，多奈哌齊組給予0.33 mg/kg多奈哌齊，DP組按低、中、高劑量分別給予10、20、30 mg/kg DP，所有大鼠均行灌胃治療，假手術組及模型組給予等量容積生理鹽水，持續治療4周。

1.2.3 六組大鼠水迷宮(Morris water maze，MWM)實驗 持續治療4周后，采用MWM實驗檢測六組大鼠學習記憶能力：①學習訓練：將大鼠分別從4個象限放入水中，記錄其在2 min內找到平臺的時間(s)，連續訓練5 d，保證每只大鼠每天訓練次數相同；②定位航行實驗：在MWM實驗的第5天，將大鼠從某一固定的象限放入水中，記錄其找到平臺的時間(s)，即為逃避潛伏時間，超過2 min的即為2 min，連續測試4 d，保證每天大鼠的入水順序不同；③空間探索實驗：定位航行實驗結束后，撤走安全平臺，將大鼠從放置平臺象限的對側放入水中，記錄大鼠2 min內穿越平臺的次數(即為探索次數)。

1.2.4 六組大鼠腦組織分離 按照“1.2.1”項中的方法將大鼠麻醉，酒精消毒后，在無菌的超凈臺剪開大鼠胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛灌注固定，直至肝臟變白、四肢僵硬，斷頭后剪開頭皮及顱骨，取出全腦，在體視顯微鏡下去除腦膜及血管后，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.5 qRT-PCR檢測六組大鼠海馬組織中Aβ mRNA表達水平 取六組大鼠海馬區域組織，用TRIzol reagent提取其總RNA，用反轉錄試劑盒將其反轉成cDNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。根據Aβ的cDNA序列設計引物，以GAPDH為內參進行qRT-PCR。PCR的反應體系：5×緩沖液10 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，上游引物F2 μl，下游引物R 2 μl，10 mmol dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl；PCR的反應條件：預變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：62 ℃ 15 s，40個循環。采用最大二階導數法(2-△△Ct)對數據進行統計，計算Aβ的相對表達量。

1.2.6 免疫組化染色檢測六組大鼠海馬組織中Aβ的表達水平 取六組大鼠海馬區域組織，用冰凍切片機制作組織切片(不超過5 μm)，將組織切片在92～98 ℃條件下存放20 min進行抗原修復，滴加正常山羊血清中和非特異性反應后，在組織玻片上滴加稀釋的兔抗鼠Aβ多克隆抗體，于4 ℃過夜放置，復溫后滴加二抗，于避光條件下室溫孵育1 h，用甘油封片后，于顯微鏡下觀察六組大鼠海馬組織中Aβ的表達情況，并采集照片(400×)。

1.2.7 Western blot檢測海馬組織中TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表達水平 取六組大鼠海馬區域組織，加入2 ml細胞裂解液，提取總蛋白，以GAPDH為內參，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣體積20 μl，電泳結束后，半干轉膜儀轉膜50 min，分別滴加兔抗鼠TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2多克隆抗體，置于4 ℃下過夜，滴加二抗后37 ℃放置1 h。加入發光劑顯影，自動凝膠成像系統采集圖像，Gel-Pro analyzer4軟件對SDS-PAGE電泳圖目的條帶進行掃描，分析TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表達水平。

2 結果

2.1 定位航行實驗檢測六組大鼠逃避潛伏時間 與假手術組相比，模型組大鼠逃避潛伏時間明顯延長(P<0.05)，提示AD模型制備成功。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠逃避潛伏時間明顯縮短(P<0.05)，且隨DP劑量增加，大鼠逃避潛伏時間逐漸縮短，呈劑量依賴性。見表1。

2.2 定位探索實驗檢測六組大鼠穿越平臺的次數 與假手術組相比，模型組大鼠穿越平臺的次數明顯減少(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠穿越平臺的次數明顯增加(P<0.05)，且呈劑量依賴性，結果如圖1所示。

2.3 qRT-PCR檢測海馬組織中Aβ mRNA表達水平 與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織中Aβ mRNA的表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中Aβ mRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2。

圖1 六組大鼠定位探索實驗穿越平臺的次數

注：A.假手術組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

圖2 qRT-PCR檢測海馬組織中Aβ mRNA表達水平

注：A.假手術組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

2.4 免疫組化染色檢測六組大鼠海馬組織中Aβ的表達水平 與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織中Aβ的表達水平升高。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中Aβ的表達水平降低，且隨著DP劑量增加，大鼠海馬組織中Aβ的表達水平逐漸降低見圖3。

2.5 Western blot檢測海馬組織中TGF-β1、SMAD2和p-SMAD2表達水平 與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織中TGF-β1的表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中TGF-β1的表達水平顯著升高(P<0.05)，且隨DP劑量增加，大鼠海馬組織中TGF-β1的表達水平逐漸升高，呈現劑量依賴性，見圖4、圖5。

表1 六組大鼠定位航行實驗逃避潛伏時間比較(s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量組比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

圖3 免疫組化染色檢測六組大鼠海馬組織中Aβ的表達水平(400×)

圖4 Western blot檢測海馬組織中TGF-β1、SMAD2和p-

注：1.假手術組，2.模型組，3.多奈哌齊組，4.DP低劑量組，5.DP中劑量組，6.DP高劑量組

圖5 海馬組織中TGF-β1的相對表達量

注：A.假手術組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

Western blot檢測結果顯示，各組間SMAD2的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織中p-SMAD2的表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，多奈哌齊組和DP組大鼠海馬組織中p-SMAD2的表達水平顯著降低(P<0.05)，且隨DP劑量增加，大鼠海馬組織中p-SMAD2的表達水平逐漸降低，呈現劑量依賴性。見圖4、圖6。

圖6 海馬組織中SMAD2和p-SMAD2的相對表達水平

注：A.假手術組，B.模型組，C.多奈哌齊組，D.DP低劑量組,E.DP中劑量組,F.DP高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，@P<0.05；與DP低劑量比較，△P<0.05；與DP中劑量組比較，▲P<0.05

3 討論

中醫學認為，AD屬于老年癡呆的范疇，以細胞外老年斑(SP)、神經細胞內神經纖維纏結(NFT)和神經元丟失為主要的病理改變[7]。大腦皮層和海馬組織中出現大量β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta，Aβ)為其直接的致病原因[8]，因此，本研究采用向大鼠大腦海馬區注射Aβ1-42磷酸鹽溶液的方法制備AD模型。結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠逃避潛伏時間明顯延長、穿越平臺的次數明顯降低，提示AD模型制備成功。

目前，治療AD的藥物主要有扁豆堿、他克林、維吖啶、多奈哌齊和西坦類藥物，這些藥物治療AD有一定療效，但也存在諸多缺點，如藥物安全范圍小、半衰期短，還會引起哮喘、心臟功能障礙、肝功能異常及消化不良等[9]。近年來研究表明，AD的發生、發展與大腦內的慢性炎癥反應密切相關[10]。Pfützner等[11]研究表明，慢性炎癥能夠促進膠質細胞釋放炎性細胞因子IL-6。IL-6能夠刺激神經細胞產生淀粉樣前體蛋白，進而促進AD的發生、發展。DP的主要有效成分是血竭素，血竭素來源于血竭，具有抗菌消炎、活血生肌的功效。袁慶等[12]研究表明，龍血竭能夠抑制小膠質細胞活化，進而抑制小膠質細胞釋放炎性因子，抑制AD的發生、發展。本研究表明，采用DP對AD大鼠模型治療后，與模型組相比，DP組大鼠逃避潛伏時間明顯縮短、穿越平臺的次數明顯增加、大鼠海馬組織中Aβ的表達水平顯著降低，且呈劑量依賴性，結果提示，DP能夠清除海馬組織中Aβ，進而抑制AD的發生、發展。

AD是一種多因素相關的神經性疾病，但具體的發病機制尚未完全明確，有研究表明，TGF-β1通路在神經系統內發揮著重要作用[13-14]。Chen等[15]在AD模型大鼠腦側注射TGF-β1，結果表明，TGF-β1能夠抑制膠質細胞介導的炎癥反應，從而減輕AD模型大鼠神經退行性病。SMAD2是TGF-β1下游的信號分子之一，TGF-β1/SMAD2信號通路能夠將細胞表面的信號傳導到細胞核，進而調節細胞核內個基因的表達。Ueberham等[16]研究表明，SMAD2在大腦和神經的發育過程中發揮著重要作用，而且參與AD的發生、發展過程。Song等[17]研究表明，Dab2能夠靶向作用于小鼠的TGF-β1/SMAD2信號通路，抑制APP/PS1小鼠腦內神經損傷，進而抑制AD的發生、發展過程。SMAD2磷酸化后，無法進入細胞核，導致p-SMAD2在細胞內異常聚集，進而導致神經元纏結。因此，降低SMAD2的磷酸化水平，有助于抑制AD的發生發展。然而DP對TGF-β1和p-SMAD2蛋白的調控尚未見報道。本研究表明，DP能夠上調TGF-β1的表達水平，下調SMAD2的磷酸化水平，進而抑制AD的發生發展，且存在劑量依賴關系。

綜上所述，DP能夠改善AD模型大鼠的學習記憶，推測這一作用是通過調控海馬組織中TGF-β1和p-SMAD2的表達水平實現的，為AD的臨床治療提供一定理論基礎。

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