JAK2-STAT3/STAT5 信號通路與兒童食物過敏CD4+T淋巴細胞亞群變化的相關性研究①

曾曉燕 胡 波 李傳應 陳必全

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230001)

兒童食物過敏又稱小兒消化系統(tǒng)變態(tài)反應、食物變態(tài)反應或過敏性胃腸炎，即因為食品或其添加劑誘發(fā)的IgE或非IgE免疫反應，從而導致小兒消化系統(tǒng)甚至全身變態(tài)反應發(fā)生，出現(xiàn)腹痛、患兒煩躁不安、甚至腸道出血等嚴重現(xiàn)象[1，2]。根據(jù)臨床流行病學統(tǒng)計，小兒食物過敏的臨床發(fā)病率高達8%，牛奶是導致其發(fā)病的最重要因素，且由于現(xiàn)代兒童喂養(yǎng)和飲食特點的改變，其臨床發(fā)病率有進一步升高趨勢[3]。因此，針對兒童食物過敏的發(fā)生和治療的研究具有重要意義和價值。CD4+T細胞作為機體最重要的免疫細胞之一，可分化為多種亞型，參與包括免疫監(jiān)視、排斥、殺傷等重要過程。而JAK2-STAT3/STAT5信號通路參與多種細胞生長調(diào)控及免疫反應發(fā)生。故本研究將首先觀察比較兒童食物過敏患兒和正常兒童外周血CD4+T淋巴細胞亞群的百分比變化，進一步針對JAK2-STAT3/STAT5信號通路進行分析，探討二者是否與過敏存在相關性及潛在調(diào)控作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 根據(jù)如下納入標準和排除標準收集2015年1月至2017年3月來我院就診的兒童食物過敏患兒78例，為過敏組；同期收集來我院體檢的健康兒童78例，為對照組。過敏組：男42例，女36例，并根據(jù)年齡分組，A組≤1歲(27例)，B組1～3歲(不包括1歲，22例)，C組3～6歲(不包括3歲，14例)，D組6～11歲(不包括6歲，15例)，體重5.65～32.71 kg，平均體重(13.7±4.9)kg。對照組：男41例，女37例，A組≤1歲(25例)，B組1～3歲(不包括1歲，22例)，C組3～6歲(不包括3歲，14例)，D組6～11歲(不包括6歲，17例)，體重5.69～32.75 kg，平均體重(13.9±4.6)kg。兩組患兒年齡、性別、體重均無統(tǒng)計學差異。

納入標準：①患兒均為牛奶所致過敏性小腸結(jié)腸炎，表現(xiàn)為皮膚、黏膜充血水腫，惡心、嘔吐、間歇性腹瀉等典型過敏表現(xiàn)，并經(jīng)血生化檢驗，血清特異性IgE檢測確診IgE所致小兒食物過敏；②患兒和正常兒童及家屬均簽署知情同意協(xié)議，愿意配合研究。

排除標準：①患兒存在其他過敏性疾病，如過敏性紫癜、哮喘或血液系統(tǒng)疾病，可影響CD4+T淋巴細胞亞群的檢測；②患兒存在慢性炎癥疾病、先天性疾病或其他疾病可影響JAK2-STAT3/STAT5信號通路的表達和活化；③患兒基礎條件較差，難以配合治療研究。

1.2方法 抽取兩組兒童外周靜脈血10 ml，分裝2管，各5 ml，分別用肝素和肝素鋰抗凝。

肝素鋰抗凝血用于流式細胞儀檢測，取1.5 ml肝素鋰抗凝血，常規(guī)分離獲得單核細胞并重懸，調(diào)整細胞懸液濃度至106ml-1，分別加入CD3-ECD、CD4-PE、CD8-perCP、CD24-FITC并留置對照管，加入同型IgG-FITC，同時給予細胞內(nèi)染色，加入抗IFN-γ、IL-4、IL-17等特異性抗體，隨后經(jīng)流式細胞儀檢測各組患兒外周血CD分子和細胞因子是否表達，及具體百分比。其中CD4+IFN-γ+代表Th1細胞、CD4+IL-4+代表Th2細胞、CD4+CD25+代表Treg細胞、 IL-17+代表Th17細胞。

肝素抗凝血用于qPCR檢測JAK2-STAT3/STAT5 mRNA表達水平，首先離心分離外周血單核細胞，采用Trizol(Life technology,USA)提取細胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，Japan)構(gòu)建cDNA，并經(jīng)SYBR GreenⅡ(TaKaRa，Japan)行定量PCR，檢測JAK2、STAT3、STAT5的表達水平。引物序列如下：JAK2:F:5′-TCTGGGGAGTATGT-TGCAGAA-3′;R:5′-AGACATGGTTGGGTGGATACC-3′;STAT3:F:5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′;R:5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′;STAT5:F:5′-GCAGAGTCCGTGACAGAGG-3′;R:5′-CCACAGGT-AGGGACAGAGTCT-3′。

分析兩組兒童上述CD4+T淋巴細胞亞群和JAK2、STAT3、STAT5表達水平的差異，采用Pearson相關性分析分析JAK2-STAT3/STAT5 信號通路和CD4+T淋巴細胞亞群的相關性。

1.3統(tǒng)計學處理 所有統(tǒng)計學分析均采用SPSS22.0軟件。本研究計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗，兩計量資料間相關性比較采用Pearson相關性分析，計算相關性系數(shù)r，若r>0，則兩組間呈正相關性，反之負相關，且P<0.05，差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1CD4+T淋巴細胞亞群比較 根據(jù)表1可知，對照組A組、B組、C組兒童Th1、Treg淋巴細胞百分比及Th1/Th2、Treg/Th17比值均明顯高于過敏組患兒A組、B組、C組，而Th2、Th17淋巴細胞百分比均小于過敏組所對應的同年齡段患兒，隨兒童年齡增大，兩組間差異均明顯減小，但差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組D組兒童和過敏組D組兒童上述指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2JAK2、STAT3、STAT5 的mRNA表達水平比較 根據(jù)表2可知，對照組JAK2、STAT3、STAT5的mRNA表達水平均明顯低于過敏組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴細胞亞群的相關性比較 由表3～6可知，針對JAK2和CD4+T淋巴細胞亞群水平進行相關性比較，A、B、C三組Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相關性系數(shù)均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相關性系數(shù)均>0(P<0.05)。針對STAT3和CD4+T淋巴細胞亞群水平進行相關性比較，Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相關性系數(shù)均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相關性系數(shù)均>0(P<0.05)。針對STAT5和CD4+T淋巴細胞亞群水平進行相關性比較，Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相關性系數(shù)均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相關性系數(shù)均>0(P<0.05)。且上述三組的相關系數(shù)絕對值逐次減小，提示隨患兒年齡增大，相關性逐漸減弱，同時，針對D組進行相關性分析，上述信號通路分子與CD4+T淋巴細胞亞群水平均無明顯相關性。

表1兩組兒童CD4+T淋巴細胞亞群比較

Tab.1ComparisonofCD4+Tlymphocytesubsetsintwogroups

GroupsControl group A(n=25)Allergic group A(n=27)Control group B(n=22)Allergic group B(n=20)Control group C(n=14)Allergic group C(n=16)Control group D(n=17)Allergic group D(n=15)Th1(%)15.42±3.519.03±2.171)15.49±3.2913.56±2.221)15.97±3.2810.23±2.571)16.59±3.2713.21±3.05Th2(%)0.73±0.161.22±0.241)0.77±0.121.12±0.231)0.75±0.150.93±0.211)0.79±0.120.98±0.25Th17(%)0.28±0.110.69±0.211)0.29±0.150.59±0.221)0.26±0.120.48±0.201)0.28±0.130.43±0.21Treg(%)10.87±2.937.21±1.861)10.99±2.947.98±1.821)10.98±2.958.36±1.821)10.05±2.569.23±1.93Th1/Th221.38±2.778.19±2.351)21.38±2.7710.12±2.631)21.56±2.7113.23±2.551)21.59±2.9618.26±2.66Treg/Th1738.68±3.1720.17±2.911)38.97±3.2623.19±2.921)38.98±3.1229.47±3.021)38.12±3.1935.19±2.52

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

表2兩組兒童JAK2、STAT3、STAT5的mRNA表達水平比較

Tab.2ComparisonofmRNAexpressionlevelsofJAK2,STAT3andSTAT5intwogroups

GroupsControl group A(n=25)Allergic group A(n=27)Control group B(n=22)Allergic group B(n=20)Control group C(n=14)Allergic group C(n=16)Control group D(n=17)Allergic group D(n=15)JAK23.21±0.976.92±1.281)3.26±0.965.78±1.321)3.28±0.914.78±1.291)3.26±0.934.91±1.23STAT33.45±1.037.26±1.231)3.47±1.026.19±1.251)3.42±1.125.25±1.201)3.87±1.174.22±1.27STAT52.93±0.876.25±1.651)2.96±0.865.32±1.091)2.91±0.824.29±1.691)2.90±0.863.29±1.63

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

表3A組JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴細胞亞群的相關性比較

Tab.3ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupA

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT5rPTh1(%)-0.923P<0.05-0.916P<0.05-0.812P<0.05Th2(%)0.918P<0.050.926P<0.050.895P<0.05Th17(%)0.865P<0.050.829P<0.050.917P<0.05Treg(%)-0.816P<0.05-0.178P<0.05-0.838P<0.05Th1/Th2-0.956P<0.05-0.931P<0.05-0.836P<0.05Treg/Th17-0.927P<0.05-0.928P<0.05-0.817P<0.05

表4B組JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴細胞亞群的相關性比較

Tab.4ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupB

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT3rPTh1(%)-0.622P<0.05-0.621P<0.05-0.523P<0.05Th2(%)0.608P<0.050.632P<0.050.498P<0.05Th17(%)0.617P<0.050.529P<0.050.479P<0.05Treg(%)-0.523P<0.05-0.128P<0.05-0.621P<0.05Th1/Th2-0.532P<0.05-0.611P<0.05-0.506P<0.05Treg/Th17-0.635P<0.05-0.508P<0.05-0.502P<0.05

表5C組JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴細胞亞群的相關性比較

Tab.5ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupC

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT5rPTh1(%)-0.321P<0.05-0.308P<0.05-0.312P<0.05Th2(%)0.319P<0.050.321P<0.050.292P<0.05Th17(%)0.309P<0.050.286P<0.050.253P<0.05Treg(%)-0.293P<0.05-0.102P<0.05-0.282P<0.05Th1/Th2-0.276P<0.05-0.293P<0.05-0.265P<0.05Treg/Th17-0.283P<0.05-0.283P<0.05-0.273P<0.05

表6D組JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴細胞亞群的相關性比較

Tab.6ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupD

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT5rPTh1(%)-0.122P>0.05-0.078P>0.05-0.081P>0.05Th2(%)0.109P>0.050.061P>0.050.053P>0.05Th17(%)0.089P>0.050.092P>0.050.068P>0.05Treg(%)-0.092P>0.05-0.073P>0.05-0.093P>0.05Th1/Th2-0.073P>0.05-0.065P>0.05-0.062P>0.05Treg/Th17-0.065P>0.05-0.058P>0.05-0.038P>0.05

3 討論

近年來，隨著兒童醫(yī)療水平的發(fā)展，各大器質(zhì)性兒童疾病的臨床治療均取得了極大的進步[4]。但小兒過敏性疾病卻日漸成為目前困擾兒童健康安全的常見疾病，如兒童過敏性哮喘、紫癜以及食物過敏等[5]。由于小兒基礎條件較差，免疫功能發(fā)育不完善，小兒主要食物牛奶、雞蛋、大豆等極易成為變態(tài)反應原，導致食物過敏現(xiàn)象的發(fā)生，不僅影響患兒的健康生活質(zhì)量，甚至可對生命安全產(chǎn)生威脅[6]。

CD4+T淋巴細胞經(jīng)刺激后可分化為Th1、Th2、Th17、Treg等亞群，其中Th1型可參與細胞免疫和IFN-γ的分泌，而Th2型主要參與體液免疫和IL-4的分泌[7]。在兒童各大過敏性反應中，Th2型CD4+T淋巴細胞的大量分化和IL-4的分泌可誘發(fā)并加重機體過敏反應[8]。此外，由于Th1/Th2型存在相互調(diào)控作用，在過敏性患兒體內(nèi)，Th2的分化和IL-4的大量合成、分泌可抑制CD4+T淋巴細胞的Th1極化[9]。

Treg是最具代表性的具有抑制作用的免疫調(diào)節(jié)細胞，可廣泛在機體內(nèi)抑制自身免疫反應，誘導免疫耐受，兒童食物過敏患兒Treg的水平明顯下調(diào)，從而導致免疫抑制失效，誘發(fā)和加重過敏現(xiàn)象[10]。此外，Th17作為新型的CD4+T淋巴細胞亞群，以IL-17的分泌為主要特征，較傳統(tǒng)的Th1和Th2型，Th17在不同疾病的發(fā)生、發(fā)展中存在多種調(diào)控作用[11]。在多種過敏性疾病中，血清IL17的表達明顯升高，且CD4+T淋巴細胞可表現(xiàn)為Th17的極化[12]。

JAK-STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條新型信號通路，其信號通路雖然較為簡單，但可參與細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導通路和細胞增殖、分化、侵襲、凋亡、免疫調(diào)控等多種重要的生物功能[13]。JAK2屬于非受體酪氨酸激酶，而STAT3和STAT5均屬于JAK2的底物，JAK2經(jīng)受體結(jié)合活化后可磷酸化STAT3和STAT5，發(fā)揮信號調(diào)控作用，進而發(fā)揮免疫調(diào)控作用，調(diào)節(jié)CD4+T細胞亞群的分布[14，15]。

由于兒童年齡跨度較大，嬰幼兒免疫力低下，隨著患兒年齡的增長，其免疫系統(tǒng)日趨成熟和完善，故本研究針對患兒進一步采用年齡分組觀察，發(fā)現(xiàn)對照組A組、B組、C組兒童Th1、Treg淋巴細胞百分比及Th1/Th2、Treg/Th17比值均明顯高于過敏組患兒A組、B組、C組，而Th2、Th17淋巴細胞百分比均小于過敏組所對應的同年齡段患兒，隨兒童年齡增大，兩組間差異均明顯減小。并針對患兒JAK2、STAT3、STAT5和CD4+T淋巴細胞亞群水平進行相關性比較，Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相關性系數(shù)均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相關性系數(shù)均>0(P<0.05)，且相關系數(shù)絕對值隨患兒年齡增大明顯減小。同時，對照組D組兒童和過敏組D組兒童上述指標差異均無統(tǒng)計學意義,信號通路分子與CD4+T淋巴細胞亞群水平在D組亦無明顯相關性。證實低齡食物過敏兒童的JAK2-STAT3/STAT5信號通路存在明顯活化和CD4+T淋巴細胞亞群改變現(xiàn)象，且JAK2-STAT3/STAT5信號通路可有效調(diào)控CD4+T淋巴細胞亞群的分布，但伴隨患兒年齡增大和免疫力的成熟，上述差異和相關性均明顯減弱，直至消失。

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