新型高效毛細管電泳整體柱拆分拉米夫定

章冰娜，沈靜茹，舒亞玲，張 思

(中南民族大學化學與材料科學學院分析化學國家民委重點實驗室，湖北 武漢 430074)

與傳統的高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)等色譜技術相比，HPCE由于其分離效率高、溶劑和手性選擇劑用量少和分析時間短等優勢獲得了越來越快的發展和應用[1]。近年來，CE在藥物分析中具有較高的應用潛力[2]。拉米夫定是臨床應用中治療效果較好、較具代表性的核苷類抗病毒藥物之一。該藥有效抑制病毒DNA多聚酶和逆轉錄酶的活性，同時對病毒DNA鏈的合成和延長有競爭性抑制作用。目前多應用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和抗艾滋病毒(HIV)的治療[3]。但拉米夫定的右旋體細胞毒性較強，對人體線粒體DNA合成存在抑制作用，會引發周圍神經病變[4]。目前拉米夫定對映異構體的分離一般以HPLC和GC為主要方式，可實現對單一對映體的含量測定。Nagasarapu[5]等在反相高效液相色譜(RP-HPLC)上用梯度淋洗模式，進行拉米夫定分散片中活性藥物的含量檢測，在流動相為0.05 mmol/L磷酸緩沖液pH值6.2，有機添加劑為乙腈的條件下，拉米夫定平均保留時間為2.8min，峰面積分離度Rs達0.66。

本文采用雙[-6-氧-(-3-間硝基苯磺酰基-丁二酸-1,4-單酯-4-)-]-β-CD(β-CD-F2)手性選擇劑制備新型HPCE手性整體柱，對拉米夫定外消旋體混合物實現手性拆分，并對拆分條件進行優化。最佳條件下，拉米夫定外消旋體混合物分離度可達22.02。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

拉米夫定對映體混合物(中國食品藥品檢定研究院)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，超高純，陶氏化學公司子公司)，磷酸(分析純，天津市科米歐化學試劑有限公司)，超純水、雙[6-氧-(3-間硝基苯磺酰基-丁二酸-1,4-單酯-4-)]-β-環糊精(自制)。高效毛細管電泳儀(P/ACE MDQ，美國BECKMAN公司)，酸度計(pHs-3c型，上海偉業儀器廠)，熔融石英毛細管(河北省永年光纖廠)，電子分析天平(FA2004型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

1.2 電泳條件

β-CD-F2整體柱為固定相，Tris-H3PO4緩沖液為流動相，所有溶液經過0.22μm微孔濾膜過濾。HPCE儀每次運行前,保證在環境濕度在60%以下，室溫20℃。先用過濾后的緩沖液頂洗整體柱10min，再加電場洗滌40min左右，重復上述操作過程，直到基線平穩。然后放入拉米夫定樣品在一定條件下自動進樣進行分析處理。

2 結果與討論

2.1 緩沖液pH值的變化對分離情況的影響

在β-CD-F2手性整體柱上，檢測波長270nm，工作電壓18KV，Tris-緩沖液濃度為50mmol/L，拉米夫定對映體混合物濃度2.69×10-3mol/L，室溫20℃，進樣時間5s，進樣壓力0.8psi條件下，改變緩沖液pH值為3.7、4.2、4.7、5.2、5.7時，分離度Rs分別為0、3.75、2.73、8.69和5.72. 緩沖溶液的酸堿度可以有效調整電遷移和電滲的平衡，從而達到增大目標物分離度的目的[6]。在β-CD-F2整體柱上，酸性條件下，Tris-磷酸緩沖液pH值的變化對拉米夫定對映體混合物的響應信號、峰形及分離度在pH值4.2～5.7范圍內有明顯的影響，存在一個最佳pH值，此時手性物質的兩對映體與β-CD-F2形成配合物的絡合平衡作用相差最大。綜合考慮，選擇pH值5.2為拉米夫定外消旋體拆分在此體系中的最佳分離pH值。

2.2 進樣量的變化對拆分拉米夫定對映體混合物的影響

在2.1條件下，選擇緩沖溶液pH值為5.2，分別進樣2.69×10-3mol/L、0.8psi和5.38×10-4mol/L、0.5psi的拉米夫定對映體混合物，確定后者較為合適，在此條件下，繼續改變進樣時間分別為3、5、8、10、12s，探究進樣量對拆分拉米夫定對映體混合物的影響，分離結果顯示最適進樣時間為5s。

2.3 工作電壓的變化對拆分拉米夫定對映體混合物的影響

在2.2的分析條件下，改變工作電壓分別為13、15、18、20、23kV。實驗結果如圖1所示。

圖1 工作電壓對拉米夫定對映體混合物分離的影響HPCE圖

Fig.1 Effect of voltage on the separation of lamivudine enantiomer

改變工作電壓對電遷移和電滲流有一定的影響，增加工作電壓有利于加快分離速度。拉米夫定兩對映體的保留時間隨著電壓的增大而減小，樣品得以更快的速度洗脫。而兩對映體的洗脫強度和分離度都呈現出一種先上升后下降的趨勢，且20kV時兩峰分離度高達20.02。大于20kV則可能由于電場強度增大，電滲速度加快，使樣品的遷移速度過大導致β-CD-F2與樣品的作用時間縮短從而選擇性降低，或由于焦耳熱過高，使拆分結果變差。綜合考慮，選擇20kV為當前體系中拉米夫定外消旋體拆分的最佳電壓。

2.4 Tris-磷酸緩沖液濃度變化對拆分拉米夫定對映體混合物的影響

在2.3的分析條件下，改變Tris-磷酸緩沖液濃度，分別為30、40、50、60、70 mmol/L。實驗結果表明，合適的緩沖液濃度對分離的選擇性和分離效率均有較大的影響，過高的緩沖液濃度可能導致焦耳熱增加影響分離[7]。結合表3數據分析可知，隨著緩沖液濃度的增加，拉米夫定兩對映體的保留時間、前峰的洗脫強度均變化不大，然而保留值和后峰的洗脫強度在50 mmol/L與其他濃度相比有明顯的增加。50 mmol/L以后，隨著緩沖液濃度的增加，后峰的洗脫強度又有所減弱。在50 mmol/L時，體系的基線平穩。綜合洗脫強度、基線情況以及分離度因素,選擇離子強度適中50 mmol/L時的濃度為當前體系的最佳緩沖液濃度。

3 結語

以β-CD-F2為手性選擇劑制備的HPCE整體柱拆分手性藥物拉米夫定對映體混合物，采用單一變量法，分別研究了Tris-磷酸緩沖液pH值、濃度、進樣量、工作電壓等對拆分拉米夫定對映體混合物的影響。通過對實驗分離條件的選擇優化，建立了手性藥物拉米夫定對映體分離分析的HPCE新方法。結果表明，拉米夫定分子結構中含有羥基、氨基、羰基，有共軛體系的六元氮雜環和五元硫氧環及共軛雙鍵等，易與β-環糊精的親水羥基產生氫鍵作用，拉米夫定及其對映體直線型的分子結構使之易進入β-環糊精的疏水空腔內。β-CD-F2上存在羧基，其與拉米夫定的氨基，羥基產生靜電引力、范德華力、氫鍵作用力，增強了HPCE整體柱的手性識別能力，增強了對拉米夫定對映體的手性拆分能力。通過優化實驗數據分析可知，pH值5.20，Tris-磷酸緩沖液濃度為50mmol/L，檢測波長為270nm，柱溫20℃，工作電壓為20kV，進樣時間為5s時，拉米夫定對映體得到了較好的分離，分離度Rs可達到22.02，且拉米夫定外消旋體混合物手性拆分后兩對映體的分離度明顯優于已有HPLC拆分的文獻[5]報道結果。

[1]Zhu Bolin,Xu Shuyin,Guo Xingjie,et al. Use of variousβ-cyclodextrin derivatives as chiral selectors for the enantiomeric separation of ofloxacin and its five related substancesby capillary electrophoresis[J]. J Sep Sci, 2017,40:1784-1795.

[2]Deeb E I,W?tzig S,Abd EI-Hady H,et al. Recent advances in capillary electrophoretic migration techniques for pharmaceutical analysis[J].Electrophoresis,2016,37:1591-1608.

[3]Marrone A,Capoluongo N,D'Amore C.Eighteen‐month lamivudine prophylaxis on preventing occult hepatitis B virus infection reactivation in patients with haematological malignancies receiving immunosuppression therapy[J].J Viral Hepat,2018,25:198-204.

[4]Warren Beach J,Lak S Jeong,Antonio J Alves.Synthesis of enantiomerically pure(2'R,5'5)-(-)-l-[2- (Hydroxymethyl)oxathiolan-5-yl]cytosine as a potent antiviral agent against hepatitis B Virus (HBV) and human immunodeficiency virus (HIV) [J].J Org Chem,1992,57:2217-2219.

[5]Nagasarapu Mallikarjuna Rao,Dannana Gowri Sankar. Development and validation of stability-indicating HPLC method for imeltaneous determination of Lamivudine,Tenofovir,and Dolutegravir in bulk and their tablet dosage form[J]. Future Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,1:73-77.

[6]Wang Shuye,Wang Yiying,Zhou Jie.Mono-6A-(4-methoxybutylamino)-6A-β-cyclodextrin as a chiral selectorfor enantiomeric separation[J].J Sep Sci,2014,37:2056-2061.

[7]Zhou Jie,Wang Yiying,Liu Yun,et al. Methoxypropylamino β-cyclodextrin clicked AC regioisomer for enantioseparations in capillary electrophoresis[J].Analytica Chimica Acta,2015,868:73-79.