AOPE基因定點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建及qPCR鑒定

覃鴻妮　謝鈺珍　杜雅馨

摘要：隨機(jī)選取5份待檢測老年癡呆癥的唾液標(biāo)本，等量混合后提取基因組DNA并通過PCR擴(kuò)增人第19號(hào)染色體上的載脂蛋白E（AOPE）基因，再與PMD19T質(zhì)粒連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)菌液PCR和測序鑒定為陽性的克隆抽取其質(zhì)粒，以此重組質(zhì)粒為模板通過PCR對(duì)AOPE基因的rs7421位點(diǎn)G突變?yōu)門，構(gòu)建的突變質(zhì)粒經(jīng)qPCR鑒定，得到相應(yīng)的熒光值，不同基因型的結(jié)果分成三類聚類圖：CC型（野生純合），CR型（雜合突變）和RR型（純合突變），將得到的熒光數(shù)據(jù)值上傳到生物信息數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，以此為依據(jù)可以從AOPE基因?qū)用嫔蠈?duì)待檢測對(duì)象的阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)做出評(píng)估。

關(guān)鍵詞：AOPE基因；定點(diǎn)突變；重組質(zhì)粒；qPCR鑒定

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），又稱老年癡呆，是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。[1]臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征。[2]近十年內(nèi)，大量研究顯示，對(duì)AD的防治雖已展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景，并研發(fā)出許多有效藥物。但中國的情況不容樂觀，中國有將近1000多萬的AD患者，未來這一數(shù)字還將不斷增加。也正因?yàn)锳D問題的嚴(yán)峻性，早期干預(yù)，早發(fā)現(xiàn)，早治療對(duì)于延緩AD病情發(fā)展甚至治愈具有極大的重要性[2，3]。

影響患者患阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素有很多，年齡占主要位置，患阿爾茨海默病的危險(xiǎn)隨著患者年齡的每增加五歲而增加一倍，且低受教育程度可明顯增加該病患病風(fēng)險(xiǎn)。[4]基因突變居于其后，第14號(hào)染色體上的早老素Ⅰ基因、第1號(hào)染色體上的早老素Ⅱ基因、第21號(hào)染色體上的淀粉樣前體蛋白基因以及第19號(hào)染色體上的載脂蛋白E基因，是目前能夠確定的突變基因，與遺傳性阿爾茨海默病有關(guān)的突變基因?yàn)榍叭撸c發(fā)散性阿爾茨海默病有關(guān)的則為aopE4基因，是最強(qiáng)遺傳性危險(xiǎn)因素[5，6]。

AOPE基因是人第19號(hào)染色體上的載脂蛋白E基因，該基因突變使得阿爾茨海默病患病率風(fēng)險(xiǎn)增加的高危險(xiǎn)因子為AOPE4，它存在于老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)中[7，8]。通過qPCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增基因信息后得到相關(guān)數(shù)據(jù)，然后運(yùn)用生物信息技術(shù)分析各種基因情況。倘若檢測的基因中含有AOPE4，則該檢測者可能存在阿爾茨海默病的患病風(fēng)險(xiǎn)，但不一定得阿爾茨海默病，然后進(jìn)行個(gè)性化指導(dǎo)用藥。讓檢測者做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防，最大限度的做到緩解或阻止疾病的發(fā)生。[9]本研究隨機(jī)選取5份待檢測老年癡呆癥的唾液標(biāo)本，等量混合后提取基因組DNA并通過PCR擴(kuò)增AOPE基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒并通過定點(diǎn)突變構(gòu)建突變質(zhì)粒，運(yùn)用qPCR平臺(tái)作為陽性質(zhì)控，將得到的熒光數(shù)據(jù)值上傳到生物信息數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，以此為依據(jù)從AOPE基因?qū)用嫔蠈?duì)待檢測對(duì)象的阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)做出評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

隨機(jī)選取5份待檢測老年癡呆癥的唾液標(biāo)本（健路生物科技（蘇州）有限公司），各取500ul混合作為基因組DNA提取的材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的獲取及定量

利用天隆NP968型核酸提取儀提取唾液基因組DNA，配套深孔板試劑加入如表3，將深孔板按照字母A處于左上方的方向及磁棒套放入儀器內(nèi)，選中程序操作。運(yùn)行1 h后下機(jī)，將深孔板置于磁力架上，避免在轉(zhuǎn)移基因組時(shí)吸到磁珠。

將基因組DNA轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，為基因組DNA定量做準(zhǔn)備。采用熒光定量法，使用熒光酶標(biāo)儀，熒光染料可以與DNA雙鏈特異結(jié)合，在485/540 nm波段發(fā)出熒光，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的濃度。

1.2.2 目的基因的PCR及PCR產(chǎn)物的純化

目的基因由金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成，提取的唾液基因組DNA作為PCR的模板，PCR產(chǎn)物吸取4ul進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的DNA片段用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.3 重組子構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物與pMD19T載體在16℃下反應(yīng)30min連接，連接產(chǎn)物采用CaCl2法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化結(jié)束后混勻菌液并涂于已經(jīng)加入Amp（100 ug / mL）的LB固體培養(yǎng)基中，倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，12 ～ 16小時(shí)后取出，觀察菌落生長狀況，無任何問題后將其放在4 ℃中保存2周。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子陽性鑒定

挑取3個(gè)單克隆，各加入含Amp（100 ug / mL）的LB液體培養(yǎng)基30ul，震蕩斡旋5min，菌液作為菌液PCR的模板，PCR產(chǎn)物先用瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性克隆菌選用載體上的M13F（47）進(jìn)行基因測序。

1.2.5 目的基因的定點(diǎn)突變

將測序結(jié)果爭取的克隆，采用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提相應(yīng)菌液中的質(zhì)粒。用Primer3設(shè)計(jì)突變引物，引物序列如表4。以質(zhì)粒為PCR模板，加入突變引物構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物中含有原始模板質(zhì)粒，為了防止其在轉(zhuǎn)化后形成假陽性轉(zhuǎn)化子，須在進(jìn)行重組環(huán)化之前進(jìn)行Dpnl消化。消化產(chǎn)物在Exnase II催化下擴(kuò)增產(chǎn)物5末端和3末端可以發(fā)生同源重組，完成擴(kuò)增產(chǎn)物重組環(huán)化過程。重組子按照13.3的方法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序結(jié)果正確的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒抽提，得到突變后質(zhì)粒。根據(jù)位點(diǎn)的基因頻率將構(gòu)建的突變前、突變后質(zhì)粒對(duì)應(yīng)野生質(zhì)粒命名為CC（基因型GG），純合突變質(zhì)粒為RR（基因型TT），雜合質(zhì)粒為CR（基因型GT）。

1.2.6 熒光PCR檢測

取1.5 mL離心管，按表5的體系配制10 uL檢測體系，裝入八連排PCR管中，轉(zhuǎn)移到通風(fēng)櫥，向分裝熒光反應(yīng)液的孔中分別加入5 uL排PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、CC質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物、RR質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物、CR質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物，蓋緊反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)，用熒光PCR儀，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。

將PCR產(chǎn)物切膠回收后，連接pMD19T，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，PCR進(jìn)行菌檢，通過凝膠電泳檢測目的條帶（圖3 A），表明挑取的3個(gè)單克隆，均能通過PCR檢測出目的條帶，且大小為472bp；將有目的條帶對(duì)應(yīng)的菌液進(jìn)行測序，其引物選用載體上M13F（47）通用引物（圖3 B），其位點(diǎn)為單一峰，第292位氨基酸密碼子堿基為G，沒有發(fā)生突變與目的序列比對(duì)一致。

2.4 突變后質(zhì)粒菌檢及測序

采用點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)質(zhì)粒進(jìn)行突變后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，PCR進(jìn)行菌檢，通過凝膠電泳檢測目的條帶（圖4 A），表明挑取的3個(gè)單克隆，均能通過PCR檢測出目的條帶，其大小為490bp；將有目的條帶對(duì)應(yīng)的菌液由蘇州金唯智測序公司進(jìn)行測序，其引物選用載體上M13F（47）通用引物，得到反向測序結(jié)果（圖4 B），其位點(diǎn)為單一峰，第294位氨基酸密碼子堿基由G突變?yōu)锳，即反向序列呈現(xiàn)出的突變位點(diǎn)堿基T，即發(fā)生突變與目的序列比對(duì)一致。

2.5 qPCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒

將構(gòu)建成功的重組CC質(zhì)粒（野生純合）和RR質(zhì)粒（純合突變）稀釋成5 ng/uL，再稀釋成102，進(jìn)一步再稀釋成104；將102的CC質(zhì)粒和RR質(zhì)粒，1：1混合在一起，再稀釋成104，作為工作質(zhì)粒。通過熒光qPCR實(shí)驗(yàn)，得到相對(duì)的熒光值，根據(jù)軟件讀取到的熒光值，結(jié)果分成三類聚類圖：CC型（野生純合），CR型（雜合突變）和RR型（純合突變）（圖5）。將得到的熒光數(shù)據(jù)值上傳到生物信息數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，可以從AOPE基因?qū)用嫔蠈?duì)阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)做出評(píng)估。圖5中的DNA樣品為實(shí)驗(yàn)室待檢測阿爾茨海默病的標(biāo)本，可見7例樣本，僅有1例基因型為CR型，其他全部為CC型。

3 結(jié)論與討論

以5份待檢測老年癡呆癥的唾液標(biāo)本為材料，提取基因組DNA并通過PCR擴(kuò)增人第19號(hào)染色體上的載脂蛋白E（AOPE）基因，再與PMD19T質(zhì)粒連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)菌液PCR和測序鑒定為陽性的克隆抽取其質(zhì)粒，以此重組質(zhì)粒為模板通過PCR對(duì)AOPE基因的rs7421位點(diǎn)G突變?yōu)門，構(gòu)建的突變質(zhì)粒經(jīng)qPCR鑒定，得到相應(yīng)的熒光值，不同基因型的結(jié)果分成三類聚類圖：CC型（野生純合），CR型（雜合突變）和RR型（純合突變），將得到的熒光數(shù)據(jù)值上傳到生物信息數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，以此為依據(jù)從AOPE基因?qū)用嫔蠈?duì)待檢測對(duì)象的阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)做出評(píng)估。

阿爾茨海默病是一種無法通過單個(gè)或多個(gè)基因篩查來進(jìn)行早期診斷的多基因疾病。通過基因組方面的研究將阿爾茨海默病的研究發(fā)展推向了新的高峰，以阿爾茨海默病本身的是否存在、癥狀、嚴(yán)重程度作為表現(xiàn)型，用信號(hào)傳導(dǎo)和基因功能的方法將其進(jìn)行說明，對(duì)阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制有了很大的幫助，在基因檢測和遺傳咨詢方面也同時(shí)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)阿爾茨海默病的預(yù)防提供更多的有效性建議。[10]

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基金項(xiàng)目：蘇州市高職高專院校教改項(xiàng)目（2017SZJG015）

作者簡介：覃鴻妮（1983），女，土家族，湖北長陽人，博士，講師，蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包學(xué)院生命科學(xué)系主任，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。