關節軟骨缺損的臨床治療及研究進展

孫祥，張 聘，趙建寧，周利武，張 雷［南京大學醫學院附屬金陵醫院（解放軍南京總醫院）骨科；南京醫科大學金陵臨床醫學院（解放軍南京總醫院）骨科，江蘇南京000］

0 引言

關節軟骨是滑膜關節的彈性負重組織，具有緩沖應力、吸收震蕩、減輕摩擦、潤滑關節表面等重要作用。當各種原因造成關節軟骨損傷時，由于缺乏血供和遷移到損傷部位的未分化細胞，其自身修復能力往往有限［1］。臨床上根據國際軟骨修復協會（interna?tional cartilage repair society，ICRS）分級法對關節軟骨損傷進行分級：①直徑1.0～2.0 mm的軟骨損傷，修復的組織與正常的透明軟骨相似；②直徑＞3 mm的軟骨損傷，又稱為關節軟骨缺損（articular cartilage de?fects，ACD），修復的組織主要為纖維軟骨，但是大多不能完全修復；③直徑＞6 mm的ACD往往不能自身修復，還會進一步損傷周圍骨壁以及周圍關節軟骨，從而引起周圍的軟骨下骨及關節軟骨的塌陷，最終不可避免的出現骨性關節炎［2］。

膝關節損傷→ACD→骨關節炎這一疾病模式在國際上及我國均常見，目前美國每年因中重度膝關節骨關節炎接受膝關節置換手術的患者已超過140萬，而且接受關節置換人數每年都在不斷地增長。我國目前尚無詳細的數據，但據估計每年接受關節置換的患者約45萬。特別是近年來，隨著我國醫療保險制度的不斷完善，這一數字持續上升。如果可以在ACD時期通過軟骨修復阻斷這一疾病過程，每年勢必將為國家節約大量醫療投入，同時也可減輕患者病痛和經濟負擔。但遺憾的是，針對ACD的治療缺乏有效方法。因此本文就ACD的臨床治療及相關研究進展作一綜述。

1 第一代修復技術

第一代以自體細胞為主，包括微骨折（1980年）、馬賽克移植（1992年）、ACI（1994年）等；第一代技術的主要缺點在于均為有創操作，且取材于自身組織，取樣部位依然會出現ACD等。

1.1 微骨折技術（microfracture，MF） MF是最早提出的軟骨缺損修復技術，該技術是由 Steadman等在1980年提出，主要原理是微骨折孔道最初的滲血中含有豐富的骨髓間充質干細胞，干細胞能夠啟動軟骨修復機制，分化為軟骨細胞填充軟骨缺損處［3］。MF主要適用于年輕患者，Sledge等［4］通過臨床試驗表明60%～80%的骨性關節炎患者通過微骨折手術治療后能夠改善關節功能，緩解疼痛。然而微骨折術后主要形成的為纖維軟骨，其生物力學性能差于透明軟骨，并且針對較大的軟骨缺損，MF的效果并不確切［5］。

1.2 馬賽克技術（mosaicplasty） 馬賽克技術又稱為自體骨軟骨移植，該技術主要是將低負重區的骨軟骨移植到骨軟骨缺損處。馬賽克技術主要適用于面積較小（＜2 cm2）的全層軟骨缺損病例，移植后受區所形成的軟骨光滑有彈性，固定牢固，大約80%的組織成分為透明軟骨［6］。雖然自體的骨軟骨生物相容性好，但是這種術式損傷了關節其他部位的骨軟骨組織，Hangody等［7］通過長期臨床研究表明供區骨關節炎的發病率大約為3%。Hunziker等［8］認為，由于骨軟骨組織是從關節的低負重區移植到高負重區，其骨軟骨的應力情況必然會發生改變，這就有可能影響術后軟骨的修復。

1.3 自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI） ACI技術最早是由 Brittberg在1994年提出，首先在關節鏡下從關節的低負重區獲取軟骨細胞，然后在通過體外培養擴增軟骨細胞，最后通過關節鏡手術把獲得的軟骨細胞移植到軟骨缺損處，并通過骨膜覆蓋［9］。ACI主要具有兩大優點：其一，使用自己的軟骨細胞可以避免潛在的免疫并發癥和感染的風險；其二，少量的取樣可以減少對患者關節軟骨的損傷［10］。然而，ACI的成功實施往往需要兩次關節鏡手術，并且組織的成熟往往需要很長時間（6～12月左右），操作過程的繁瑣與耗時阻礙了ACI技術運用于臨床治療［11］。 Hjelle 等［12］研究表明，雖然ACI技術取樣來自于關節非負重區，但是取樣區后期仍有發生骨性關節炎的風險。

2 第二代修復技術

第二代修復技術在自體細胞的基礎上增加了細胞外基質，包括基質誘導的ACI（MACI，2002年）。第二代技術的主要缺點在于細胞外基質的不確定性，往往導致移植的軟骨結構不穩，并且與周圍軟骨組織無法有效連接，從而導致力學性能下降。

第二代技術認為傳統的ACI技術由于缺乏生物支架提供結構性的支持，軟骨細胞的再生率有限，而MACI技術首先將體外擴增的軟骨細胞種植在一種可吸收性的豬源性混合膠原膜（主要由Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原組成），然后通過纖維蛋白膠固定到軟骨缺損處，這種膠原膜作為生物支架能夠提供潤滑作用，并且有利于軟骨細胞的滲透［13］。MACI技術與ACI技術相似，同樣需要兩次關節鏡手術，其操作過程也同樣繁瑣，不利于臨床運用。Bartlett等［14］通過在關節鏡下觀察 MACI與 ACI治療的病例組織學結果表明，MACI修復技術移植的軟骨細胞有肥大的可能性。

3 第三代修復技術

第三代修復技術運用組織工程的方法，包括NT／ET（軟骨塊和自然纖維蛋白膠的混合物，Denovo公司，2008年）、CAIS（自體軟骨植入系統，Depuy公司，2012年），3D生物打印技術等；第三代技術的主要缺點是其種子細胞來源于同種異體的新生兒臍帶血干細胞，存在一定的排異性和療效不確定性，且價格十分昂貴。

組織工程技術主要致力于在體外或體內（原位）構建與正常關節軟骨結構與功能相類似的關節軟骨，從而實現關節軟骨無創性修復［15］。組織工程修復技術的成功實現主要包括三大關鍵因素：種子細胞、生物支架、信號分子。種子細胞是組織工程修復技術的基礎，通過培養可分化為軟骨細胞的干細胞可獲得充足的種子細胞，這有利于克服傳統治療技術供體不足的缺點。由于間充質干細胞具有容易獲取、自我更新能力強等特點，目前組織工程采用的種子細胞主要為間充質干細胞，包括骨髓間充質干細胞（bone manrrow mesenchymal stemcells，BMSCs）和滑膜間充質干細胞（synovium?derived mesenchymal stem cells，SMSCs）等。生物支架同樣也是組織工程修復技術的必備條件之一，它為種子細胞提供支持的三維結構，并且可以指導軟骨組織的生長過程，從而促成軟骨損傷修復［16］。目前生物支架的類型主要包括蛋白質類聚合物、碳水化合物類聚合物、人造聚合物以及前三者的混合聚合物。Lu等［17］認為理想的生物支架除了具有良好的生物相容性、生物可降解性、低毒性，還應該與關節軟骨具有良好的整合性。組織工程修復技術中，特異的信號分子在誘導干細胞特異性分化的過程中同樣具有至關重要的作用。這些信號分子主要通過刺激軟骨細胞蛋白多糖、膠原的合成，抑制基質的降解等作用來促進軟骨損傷的修復［18］。

最新的組織工程修復技術主要包括Denovo NT／ET（軟骨塊和自然纖維蛋白膠的混合物）、CAIS（Depuy自體軟骨植入系統）、3D生物打印技術等。Denovo NT／ET自2007年引入臨床，并有成功治療距骨軟骨關節炎的病例報告［19］。CAIS技術實質上是ACI技術的進一步發展，Cole等［20］對29例患者的前瞻性隨機對照試驗中將CAIS與MF相比，基于IKDC和KOOS評分，接受CAIS的患者24個月后較接受MF治療的患者獲得了更好的臨床效果。然而這兩種技術屬于同種異體移植，患者有發生免疫反應和傳播疾病的風險［20］。傳統的組織工程技術由于種子細胞不能有效地接種到支架材料內，導致無法理想構建三維結構的軟骨。最新的研究表明，3D生物打印技術有望克服這一缺陷，Cui等［21］通過將牛股骨髁制成體外骨軟骨樣缺損模型作為“3D生物紙”，然后以聚乙二醇?二甲基乙酰胺聚合物和人軟骨細胞混合水凝膠為生物墨水，利用3D生物打印生成軟骨，組織學觀察顯示軟骨細胞在水凝膠支架內分布均勻，打印產物表面有較多的蛋白聚糖沉積，且存活率較高。然而通過3D生物打印技術制造的組織工程軟骨生物相容性是否良好，生物應力效果如何，這些疑問還有待進一步臨床試驗證實。

4 在研中的第四代修復技術

上述三代技術共有的缺點是在處理4 mm以上的ACD時效果一般，原因在于上述技術過程無法模擬生理自我修復過程，從而無法形成天然的軟骨組織，而移植或形成的軟骨組織缺乏和周圍軟骨的有效整合使得其力學性能出現改變，如壓縮后無法回彈、應力分布過于集中造成軟骨下骨損傷等。因此規劃中的第四代修復技術需要另辟蹊徑。研究［22］認為，提高機體自身的軟骨修復能力可能是未來之路的突破方向。

4.1 種子細胞 生理狀態下，當ACD發生時，滑膜作為干細胞的儲存器會移行到關節軟骨缺損處，和其他局部細胞一起參與ACD修復過程［23］。基于這一現象，De Bari等［24］在人體滑膜組織中分離出一種具有高度增殖能力，并且可以向多種細胞分化的細胞，經鑒定后命名為SMSCs。SMSCs在表現出一般成體干細胞生物學行為的同時，尚具有高度成軟骨分化能力，在體內和體外實驗中均表現出了突出的ACD修復能力［25］。 相對于傳統的 BMSCs，SMSCs因具有取材方便、對患者創傷小、細胞量大、成軟骨能力強等優點有望成為目前最理想的ACD修復種子細胞。

4.2 分化條件 研究［26］表明，在 SMSCs促進軟骨細胞增殖與分化的過程中，有多種信號通路參與其中，這些通路主要包括Wnt通路、TGFβ?BMPs通路、FGF通路、NF?κB通路通路、MAPK通路等，其中較為重要的為 Wnt通路和 TGFβ?BMPs通路。 Zhang 等［27］研究表明Wnt通路可促進SMSCs的成軟骨化，而介導這一過程主要由Sox4通過lncRNA DANCR激活下游的 CTNNB1?β?catenin 實現。 在 TGFβ?BMPs通路中，Smad4蛋白與磷酸化的 R?Smads（包括 Smad2／3 和Smadl／5／8兩種）形成復合物，然后Smad蛋白異二聚體遷移入核，并在核中與其相關聯的轉錄因子結合來調節下游基因轉錄，從而促進軟骨細胞的增殖與分化［28］。

4.3 LncRNA在其中的作用 SMSCs參與ACD修復的關鍵點在于促進其向軟骨細胞增殖和分化。近來年，研究［29］表明多種長鏈非編碼 RNA（long non?coding RNA，lncRNA）參與了這一過程。lncRNA是一類缺乏蛋白質編碼功能的RNA，其轉錄本長度超過200個核苷酸［30］。 近期的研究［31］認為這是一類重要的調節分子，參與許多重要的生物學功能，在表觀遺傳水平、轉錄水平、翻譯水平、蛋白修飾過程中均可發揮重要的調控細胞分化的作用。在調控軟骨代謝方面，lncRNA的主要機制如下。①直接斷裂為microRNA發揮調控作用。有研究［32］表明 lncRNA?H19作為前體可通過經典的Drosha?Dicer拼接方式產生miR?675，miR?675可作用于組蛋白去乙酰化酶3’非翻譯區（HDAC）4、5、6 轉錄本，調控骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化。②通過microRNA發揮調控作用。 研究［33］發現 lncRNA?DANCR（differentiationantagonizing non?protein coding RNA，DANCR）可通過與 CTNNB1 相互作用，阻斷下游 miR?214、miR?320a和miR?199a對CTNNB1的抑制作用，而進一步研究證實 CTNNB1／β?catenin可經 Wnt通路促進 SMSCs向軟骨細胞分化。③通過轉錄因子調控軟骨的分化。有研究表明上調lncRNA?HIT可直接調節p100／CBP的活性從而促進成軟骨［34］，上調 lncRNA?MAEL可直接調節OCT4、SOX2進而調節軟骨代謝［35］。④通過作為競爭性內源性RNA發揮調控作用。研究［36］發現lncRNA?MSR可以作為 miR?152的競爭性內源RNA，抑制TMSB4的表達，增加基質金屬蛋白酶的表達，參與細胞外基質的降解，導致細胞骨架的破壞，從而造成ACD。基于lncRNA在軟骨增殖分化過程中的調控機制，未來如果能發現這一過程中的關鍵調節點，將有望通過這一關鍵點實施臨床干預，進而通過增強軟骨自身的代謝真正實現軟骨缺損的修復。

5 展望

根據目前的組織工程修復技術，主要是通過體外獲得的軟骨來修復損傷的關節軟骨，如果未來能夠在體內實現關節軟骨損傷的修復，即關節軟骨損傷的原位修復，或許能突破目前種種修復方案的弊端，真正實現關節軟骨損傷的修復。結合目前最新的研究進展，本綜述作者預測未來可能有如下兩種發展方向。①通過研究體內軟骨自我修復的生理過程，是否能夠找到促進軟骨修復的主要通路，并找到影響這些通路的因素（例如lncRNA?DANCR），最終真正實現軟骨損傷的原位修復；②通過研究軟骨損傷過程，是否能夠找到引起軟骨退變的通路，如若能夠阻斷這一通路，就能阻斷或減緩ACD的發生，從而從本質上實現對關節軟骨損傷的修復。當然這些構想還有待廣大研究學者的進一步研究，希望未來能真正實現從關節軟骨損傷的原位修復，進而為廣大骨性關節炎的患者帶來福音！

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