兔肝腫瘤射頻消融術后循環(huán)血中T細胞、NK細胞的表達

楊闖 張永川 古廣強 何靜宇

（綿陽市第三人民醫(yī)院 四川 綿陽 621000）

引言

射頻消融是近年來被廣泛用于實體瘤治療的一種新型微創(chuàng)技術，其在應用時采用超聲引導，經(jīng)電極針向腫瘤中心做定點發(fā)射，使肌瘤處于帶電狀態(tài)，在高頻交流電的作用下，促使實體瘤內(nèi)的離子發(fā)射高頻振動，產(chǎn)生熱量，從而達到使腫瘤細胞脫水、凝固、壞死的目的[1]。雖然目前臨床中對于射頻消融技術治療效果方面的研究較多，但是關于其對機體免疫功能的影響報道較少。本次研究將通過建立兔肝臟原位種植XV2腫瘤模型，行射頻消融治療（RFA）后，探討射頻消融術對荷瘤兔機體免疫反應的影響情況。

1.資料及方法

1.1 實驗動物

研究選取純種的3～4月齡新西蘭大耳兔共28只，體重在2.5～3.5kg之間，雌雄比例不限。所有種兔均為已建立好的長有VX2腫瘤的研究用兔。根據(jù)是否進行射頻消融治療，將28只分為對照組（10只）和射頻消融組（18只），兩組兔子的基本情況和發(fā)病情況相似，P＞0.05，具有可對比性。

1.2 主要試劑及儀器

射頻治療采用美國Radio Therapeutics公司生產(chǎn)的RF 2000TM射頻治療系統(tǒng)，射頻消融針采用該設備配套射頻消融針，應用美國BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)的Epics XL型流式細胞儀。血管內(nèi)皮生長因子受體試劑盒由邁新生物技術有限公司提供，Bcl-2酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒由北京瑞格博科技有限公司提供。

1.3 標本采集及處理

所有對照組荷瘤兔不進行治療，射頻消融組荷瘤兔在超聲引導下行射頻消融進行治療，在射頻消融后1周、2周、4周時，采集兩組荷瘤兔兔耳部（中央）動脈血10ml，置入肝素抗凝無菌試管內(nèi)，離心備用。將射頻消融組荷瘤兔分別分為三組，分別在術后1周、2周和4周時處死，選取行射頻消融治療后的凝固行壞死組織及其便于1cm組織作為標本，待用。

1.4 實驗方法

將采集到的外周血標本應用Epics XL型流式細胞儀，對兩組荷瘤兔的T細胞濃度、T細胞活性以及NK細胞比例進行檢測。同時采用免疫組化法，應用相應的試劑盒，對兩組荷瘤兔Bcl-2和VEGF水平進行檢測，檢測時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行分析，等級資料用秩和檢驗，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料數(shù)據(jù)以率（%）表示，兩組比較用χ2檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 T細胞及NK細胞表達

在治療前，兩組荷瘤兔的T細胞亞群和NK細胞表達水平基本接近，P＞0.05，不具有統(tǒng)計學意義。但在治療后，兩組荷瘤兔的各項指標水平具有著明顯的差異性，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 兩組荷瘤兔治療前后T細胞亞群和NK細胞水平對比

2.2 VECF和Bcl-2的表達

射頻中心損毀區(qū)域內(nèi)無VECF表達，但在殘余腫瘤區(qū)域內(nèi)可見VECF表達，射頻組荷瘤兔的VECF表達水平明顯低于對照組。而對照組荷瘤兔的Bcl-2也明顯高于射頻消融組，P＜0.05，不具有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 不同時段兩組荷瘤兔VECF表達水平分析

圖1 Bcl-2免疫組化

3.討論

VX2腫瘤是一種由Shope病毒所誘導的兔乳頭狀瘤所衍生出的一種鱗癌[2]。本次研究以腫塊預埋發(fā)制備出所需的兔肝腫瘤模型，方法簡便，可操作性強。射頻消融術是近年來被用于實體瘤治療的一種新型微創(chuàng)治療技術[3]，利用離子之間相互碰撞產(chǎn)生熱量的原理，提高局部溫度，從而達到使腫瘤細胞脫水、凝固、壞死的目的[4]。由于射頻消融在用于腫瘤治療是主要是依靠高溫原理來殺滅腫瘤細胞，使得病灶組織凝固、壞死，故而其效果類似與手術切除。由于熱效應對于機體的免疫力有著良好的促進效果，故而行射頻消融治療能否對機體的免疫功能產(chǎn)生影響，成為近年來臨床中研究的一個熱門問題。

T臨床亞群細胞的平衡情況是維持機體內(nèi)部免疫系統(tǒng)環(huán)境平衡的重要因素，而CD4+/CD8+比值則為機體內(nèi)部免疫狀態(tài)是否動態(tài)穩(wěn)定的重要表達指標，如比值過低，則提示機體的免疫能力下降。本次研究結(jié)果顯示，在未進行治療前，對照組與觀察組各項指標水平是基本接近的（P＞0.05），但在經(jīng)射頻消融治療后兩周左右時，兩組荷瘤兔的指標水平明顯改善（P＜0.05），但是RFA治療組的荷瘤兔機體免疫細胞活性呈現(xiàn)小幅上升趨勢，而到治療4周左右時，射頻消融組荷瘤兔的免疫細胞活性水平與對照組呈現(xiàn)出明顯的差異性，這可能與熱效應能夠增加荷瘤兔機體免疫能力，經(jīng)過射頻消融治療后，凝固壞死的腫瘤組織仍然殘留在機體內(nèi)，激活免疫系統(tǒng)以及機體本身腫瘤負荷減少有關。故而我們認為，射頻消融術能夠通過對腫瘤微血管的破壞作用，控制腫瘤血管的形成，同時還能夠提高機體的免疫能力。

4.結(jié)論

射頻消融技術作為一種新型實體瘤治療方案，其在用于肝臟腫瘤治療時，能夠顯著提高機體的細胞免疫能力，對于延長生存期有著重要的意義，其具體作用機制還需要進一步研究證實。

[1]朱迎,欽倫秀.肝癌免疫生物治療的現(xiàn)狀及評價[J].中國實用外科雜志,2016,14(6)：636-41.

[2]張洪新,劉燕,曹偉,等.兔肝VX2移植癌改良模型的建立[J].腫瘤防治研究雜志,2002,29：1-3.

[3]VARNEY M L，SINGH RK．VEGF-C-VEGF R 3/Flt4 axis regu lates mammary tumor growth and metastasis in an autocrine manner[J].Am J Cancer R es,2015,5(2)：616-628.

[4]Ronnie TP.Prevention of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma：A daunting challenge[J].Hepatology,2011,54(3)：757-759．