LncRNA RP11-401E9.3在小細胞肺癌中的表達及臨床意義

謝孝川 劉清松 敬敏 李季

（1內江市第一人民醫院病理科 四川 內江 641000）（2內江市第一人民醫院胸外科 四川 內江 641000）

小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）占所有肺癌的大約15%，是目前臨床治療中棘手的腫瘤之一[1]。與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在靶向治療方面的飛速發展相比，SCLC發生發展的潛在機制仍未可知，缺乏可用于臨床靶向治療的驅動基因，現有治療手段仍然以傳統的化療和放療為主[2]。由于SCLC倍增時間短，雖然其對于化療敏感，但很快就會出現復發轉移，導致治療失敗和死亡[3]。因此，化療耐藥的導致小細胞肺癌治療失敗的重要原因，其具體機制目前尚未完全闡明，可能涉及眾多耐藥相關基因的調控異常。

LncRNA是指一類長度超過200個核苷酸的RNA分子的總稱，是當今分子生物學研究的熱點之一[4]。雖然在人類基因組中已經發現了一些LncRNA，但關于其對基因組的調控及具體機制尚不清楚。前期預實驗通過LncRNA芯片發現長鏈非編碼RNA AC009336.24在SCLC耐藥細胞株中的表達較化療敏感細胞株明顯增高，提示LncRNA AC009336.24可能與SCLC的耐藥相關，然而關于LncRNA AC009336.24在SCLC中的表達及意義目前國內外尚未見相關報道。本研究應用實時熒光定量PCR法檢測LncRNA AC009336.24在SCLC組織中的表達，分析其表達與患者臨床病理特征及化療敏感性的關系。

1.資料與方法

1.1 病例資料

收集于2012年06月至2017年06月在我院腫瘤科、胸外科及呼吸內科進行手術或穿刺活檢或支氣管鏡活檢的SCLC組織標本96例，其中30例手術切除的SCLC的癌旁組織（距離癌組織≥2cm），66例未進行手術治療的患者的癌組織取自支氣管鏡或CT引導下的穿刺活檢標本。所有患者的病例資料完整，手術前均未接受過放化療。同期收集40例因各種原因導致肺外傷的正常肺組織標本作為對照組。96例患者均接受以鉑類為主的化療，首先給予一線化療方案（依托泊苷＋鉑類）化療；出現耐藥后，給予二線化療方案（伊立替康＋鉑類）。其中化療敏感者（化療4～5個周期后腫瘤縮小30%以上或消失）42例，化療耐藥者（化療4～5個周期后腫瘤增大30%或以上，或出現新的轉移灶）54例；其中54例耐藥者給予二線化療方案治療。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 隨訪

所有患者出院后都進行了隨訪，隨訪時間為3～58個月，中位隨訪時間為33個月，隨訪截止日期為2018年2月1日。至隨訪結束，存活30例，死亡66例，無失訪病例。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測SCLC組織中LncRNA RP11-401E9.3的表達水平

采用TRIZOL提取總RNA。將提取的總RNA，按如下條件進行逆轉錄反應：37℃，15min的逆轉錄反應，98℃，5min的酶失活反應，反轉錄產物于-20℃保存。Real-time PCR采用2*SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA 作為摸板進行擴增，以GAPDH作為內參照，以 RQ=2-ΔΔCt 的方法進行分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件分析數據。計量資料采用One way ANOVA或t檢驗進行分析，采用均數±標準差表示。采用Chi-Square檢驗分析LncRNA AC010145.4與各臨床病理參數之間的關系；采用Kaplan-Meier法分析患者生存時間的關系，單因素及多因素分析影響SCLC預后的因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 LncRNA RP11-401E9.3在SCLC組織中高表達

實時熒光定量PCR檢測LncRNA RP11-401E9.3在96例SCLC組織、30例癌旁組織及40例正常肺組織中LncRNA RP11-401E9.3的表達，結果提示， LncRNA RP11-401E9.3在SCLC組織中的平均表達水平（9.678±1.730）顯著高于癌旁組織（1.570±0.690）及正常肺組織（1.475±0.450），差異有統計學意義（F=30.10，P＜0.001）。進一步分析發現LncRNA RP11-401E9.3在54例耐藥患者中的平均表達（6.902±0.187）明顯高于化療敏感者（12.360±0.221，n=42），差異具有統計學意義（t=17.490，P＜0.001）。

2.2 LncRNA RP11-401E9.3的表達與SCLC患者臨床病理特征的關系

患者的基本資料見表1。根據LncRNA A RP11-401E9.3平均表達水平（9.678）將SCLC患者分為LncRNA RP11-401E9.3高表達組（LncRNA RP11-401E9.3≥9.678）50例及低表達組（LncRNA RP11-401E9.3＜9.678）46例。進一步分析LncRNA RP11-401E9.3表達與患者臨床病理特征的關系，結果發現，LncRNA RP11-401E9.3表達與患者的年齡、性別（P值均＞0.05）無關；而與疾病分期、淋巴及遠處轉移、化療敏感性及患者的生存狀態明顯相關（P值均＜0.05，見表1）。

表1 LncRNA RP11-401E9.3表達與SCLC患者臨床病理特征間的關系Table 1 The relationship between LncRNA RP11-401E9.3 expression and pathological characteristics in patients with small cell lung cancer （SCLC）

2.3 SCLC患者生存分析

采用Kaplan-Meier法分析發現LncRNA RP11-401E9.3高表達患者的無進展生存時間[（11.76±1.03）個月]短于低表達者[（21.89±1.64）個月]，差異有統計學意義（χ2=34.12，P＜0.00）；LncRNA RP11-401E9.3高表達患者的總生存時間[（36.64±1.75）個月]短于低表達者[（23.68±1.27）個月]，差異有統計學意義（χ2=30.72，P＜0.001）。

2.4 單因素及多因素分析影響SCLC患者預后的因素

單因素及多因素分析結果顯示，疾病分期、遠處轉移、LncRNA RP11-401E9.3表達是SCLC患者預后的獨立影響因素（P值均＜0.05，見表2）。

表2 影響 SCLC患者OS的臨床病理因素Table 2 The clinicopathological factors affecting the OS in SCLC patients.

3.討論

小細胞肺癌是一種有著高死亡率的侵襲性惡性腫瘤[5]。由于缺乏有效的針對SCLC的靶向藥物，目前仍以傳統的化療治療及放射治療為主，但療效差，極易出現復發和轉移[6]。因此，臨床急需尋找新的生物標志物去早期診斷及預后評估小細胞肺癌。

近年來的研究發現,LncRNA在多種類型腫瘤細胞中表達，有望成為新的腫瘤標志物和腫瘤治療靶點[7]。研究發現，LncRNA HOTTIP通過富集miR-216a增加BCL-2的表達，誘導小細胞肺癌的化療抵抗[8]。LncRNA HOTTIP的表達與小細胞肺癌的疾病進展和預后相關[9]。LncRNA HOTAIR通過調節HOXA1的甲基化影響小細胞肺癌的化療耐藥[10]。LncRNA TUG1通過EZH2調節LIMK2b的表達影響小細胞肺癌的細胞增殖和化療藥物耐藥[11]。本研究發現SCLC組織中LncRNA RP11-401E9.3的表達水平明顯高于癌旁組織及正常肺組織。LncRNA RP11-401E9.3在化療耐藥患者中的表達明顯高于化療敏感者；LncRNA RP11-401E9.3表達與SCLC患者的性別、年齡無關，而與疾病分期、淋巴結轉移、遠處轉移、化療耐藥相關。高表達LncRNA RP11-401E9.3患者的總生存時間及無進展生存時間均短于低表達者。LncRNA RP11-401E9.3表達是SCLC患者獨立的預后因素。以上研究結果提示，LncRNA RP11-401E9.3參與調節SCLC的發生和發展，可能作為潛在的SCLC患者療效及預后評估的生物標志物。然而，影響SCLC預后的分子機制復雜，LncRNA RP11-401E9.3調節SCLC患者預后的具體作用機制及參與的信號通路，尚需進一步研究。

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[4]Meng, M., et al.Long non-coding RNA ENST00462717 suppresses the proliferation, survival, and migration by inhibiting MDM2/MAPK pathway in glioma[J].Biochem Biophys Res Commun,2017.

[5]Tao, H., et al.The impact of coexisting lung diseases on outcomes in patients with pathological Stage I non-smallcell lung cancer[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg,2018.

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[8]Sun, Y., et al.Long non-coding RNA HOTTIP promotes BCL-2 expression and induces chemoresistance in small cell lung cancer by sponging miR-216a[J].Cell Death Dis,2018;9（2)：85.

[9]Sun, Y., et al.A long non-coding RNA HOTTIP expression is associated with disease progression and predicts outcome in small cell lung cancer patients[J].Mol Cancer,2017;16（1)：162.

[10]Fang, S., et al.Long noncoding RNA-HOTAIR affects chemoresistance by regulating HOXA1 methylation in small cell lung cancer cells[J].Lab Invest,2016;96（1)：60-8.

[11]Niu, Y., et al.Long non-coding RNA TUG1 is involved in cell growth and chemoresistance of small cell lung cancer by regulating LIMK2b via EZH2[J].Mol Cancer,2017;16（1)：5.