CHB患者肝組織中IL-32與IL-1β、TNF-α細胞因子相關性

李莉 李剛(通訊作者) 曹紅 舒欣 王萬志 胡立立

（1黔西南州人民醫院全科醫學科 貴州 興義 562400）（2中山大學附屬第三醫院感染性疾病科 廣東 廣州 510000）（3黔西南州人民醫院腫瘤科 貴州 興義 562400）

全球有約3.5億人感染乙肝病毒（hepatitis virus B，HBV）。HBV是一種嗜肝DNA病毒，在肝細胞內復制對肝細胞不直接造成損傷[1]。目前認為機體免疫系統針對病毒及病毒抗原的免疫反應在清除病毒的同時導致肝細胞損傷而發生肝炎。多種細胞因子在HBV感染后表達增高、聚集肝組織，誘導多種免疫細胞分化、成熟、聚集肝組織，導致肝內細胞因子網絡活化，引起肝組織損傷，發生病毒性肝炎[2]。目前IL-32、IL-1β、TNF-α炎癥因子水平與CHB的關系是研究的熱點[3]。因此本文擬CHB患者肝組織中IL-32與IL-1β、TNF-α細胞因子相關性，以了解IL-32在CHB肝損傷發生中的作用，為以炎性因子為靶點的CHB治療提供依據。

1.資料與方法

1.1 資料

收集廣州中山大學附屬第三醫院感染科和我院2012年10月—2017年9月明確診斷為CHB的患者，共計106例，根據患者肝組織標本，分為40例輕度CHB組、30例中度CHB組、36例重度CHB組。收集兩院健康人群的正常肝組織標本100例，作為對照組。CHB組男55例，女51例，平均年齡46.38±13.82歲。對照組男66例，女34例，平均年齡43.25±15.28歲。兩組性別和年齡比較無差異。

1.2 入選標準

（1）CHB組確診有乙肝病毒感染，病史大于3月。（2）所有研究對象臨床資料完整，知情同意。

1.3 排除標準

（1）腦、肝、腎等重要臟器功能不全者。（2）嚴重精神障礙、認知功能障礙者。

1.4 研究方法

測定IL-32與IL-1β、TNF-α指標：

所有研究對象納入研究后，抽取早餐空腹肘部靜脈血。進行實驗室檢查。（1）用Percoll不連續密度梯度離心分離肝內MNCs：把盛有肝組織的器皿置于冰上，把肝組織剪碎至約1mm3大小，加入預先制冷的1640培養基（含10% FBS）中懸浮，把組織懸浮液過200目不銹鋼網，用注射器內芯輕輕研磨，并加入1640培養基（含10% FBS）沖洗，取濾液約40～45ml轉入50ml離心管中，550r/min離心3分鐘，把上清轉入另一個50ml離心管，1500r/min離心10分鐘，棄上清，3ml 40% percoll重懸沉淀，緩慢加至3ml 70% percoll分離液上，2400r/min離心20分鐘，從40%與70%percoll分界面上小心吸取肝內MNCs細胞，然后洗滌，調整細胞濃度為106/ml。（2）構建IL-32表達載體及IL-32 siRNA載體A構建IL-32表達載體：提取人全基因組DNA，合成擴增IL-32基因片段的引物，PCR擴增IL-32基因，雙酶切后連接至pCMV表達載體；菌落PCR鑒定、酶切鑒定、測序鑒定。B構建IL-32 siRNA載體：在pubmed基因庫中獲取IL-32編碼序列；利用軟件設計針對IL-32基因序列的siRNA序列；合成siRNA序列并插入pGenesil-1表達載體；菌落PCR鑒定、酶切鑒定、測序鑒定。（3）IL-32表達載體及IL-32 siRNA載體分別轉染MNC細胞，real-time PCR、ELISA分別檢測轉染前后TNF-α、IL-8、MIP-2、IL-1β、IL-6等細胞因子的表達水平。

1.5 觀察指標

對比CHB組和對照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平；輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平；CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α的相關性。

1.6 統計學

采用SPSS17.0軟件，計數資料χ2檢驗，計量資料t檢驗或方差分析，P＜0.05為差異有意義。

2.結果

2.1 CHB組和對照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平

CHB組和對照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），見表1。

表1 CHB組和對照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平

2.2 輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平

輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），見表2。

表2 輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平

2.3 CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α的相關性

IL-32與IL-1β、TNF-α均呈正相關，相關性系數分別為0.652、0.687，比較有差異（P＜0.05）。

3.討論

本次研究發現CHB組和對照組IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），即CHB患者的IL-32、IL-1β及TNF-α水平表達高于健康人群。有文獻指出HBV編碼的HBx蛋白誘導肝細胞表達IL-32，而且發現CHB患者肝組織中IL-32表達增高，且IL-32表達水平與CHB炎癥程度呈正相關，因此推測IL-32在CHB肝損傷發生中起重要作用。同時HBV、HCV、Influenza A等多種病原體均可誘導免疫細胞及非免疫細胞表達IL-32，IL-32通過活化NF-κB和p38 mitogen-activated protein kinase（MAPK）信號通路誘導TNF-α、IL-1β細胞因子表達，在慢性丙型病毒性肝炎（CHC）肝組織炎癥及纖維化發生中起重要作用[4]。

本次研究還發現輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05）。即隨著CHB損傷的加重，會造成IL-32與IL-1β、TNF-α水平表達的升高，這可能與IL-32、IL-1β、TNF-α參與CHB肝臟損傷有關[5]。TNF-a在細胞免疫和炎癥反應中扮演重要的角色[6]。有研究顯示TNF-a可激活單核-巨噬細胞釋放TNF-a而影響肝臟免疫系統，同時TNF-a表達上升后可使大量炎性細胞粘附于血管內皮，促進肝臟纖維化[7]。IL-1β為急性期炎癥指標，可刺激造血細胞和T、B細胞增殖分化，調節宿主對微生物感染的免疫反應[8]。IL-1β水平上升后可以可以促進粘附分子表達上升，引起單核細胞聚集與浸潤，促進CHB病情的發展。IL-32是新發現的促炎癥細胞因子，肝內細胞因子聚集及活化CHB肝損傷的重要原因。有學者發現CHB患者的病理肝臟組織中IL-32水平為健康人群的1.23倍[9]。基本與本次研究一致。

本次研究發現輕、中、重度CHB患者IL-32與IL-1β、TNF-α水平比較有差異（P＜0.05），即IL-32表達的上升會造成IL-1β、TNF-α表達升高，之間互為因果，互相惡化。因此本文認為CHB患者肝組織中IL-32表達明顯高于健康人群，IL-1β、TNF-α細胞因子的過量表達可能與IL-32有關。

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[4]鄒美銀,章幼奕,朱勇根,等.乙肝病毒相關肝細胞肝癌與IL-32表達相關性研究[J].中華腫瘤防治雜志,2017,24(12)：835-838+844.

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