風(fēng)濕類產(chǎn)品中非法添加對乙酰氨基酚快檢方法的研究

張錦文 謝靖威 郭素

（廣州市從化區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所 廣東 廣州 510900）

1.研究背景

對乙酰氨基酚，化學(xué)名為4-羥基乙酰苯胺，英文名為4-Acetamidophenol,CAS No.103-90-2,分子式為C8H9NO2。化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

有解熱鎮(zhèn)痛作用，是最常見的非抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥，是乙酰苯胺類藥物中最好的品種。特別適用于不能應(yīng)用羧酸類藥物的病人。被廣泛用于感冒發(fā)燒、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛、及手術(shù)后止痛等，不良反應(yīng)較少。偶見皮疹、蕁麻疹、藥熱、血小板減少癥及白細(xì)胞減少癥（如粒細(xì)胞減少）。長期大量用藥會(huì)導(dǎo)致肝腎功能異常。劑量過大可引起肝臟損害，嚴(yán)重可致昏迷甚至死亡。

最近，有文獻(xiàn)和新聞報(bào)道，某些中藥制劑和保健食品中有人非法添加對乙酰氨基酚以增強(qiáng)其藥效[1,2,3]。如果消費(fèi)者購買服用該類產(chǎn)品，極有可能攝取過量的對乙酰氨基酚導(dǎo)致產(chǎn)生不良反應(yīng)。對此類非法添加行為，應(yīng)予嚴(yán)厲打擊。國家食品藥品監(jiān)督管理局曾發(fā)布藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號：2009025）對抗風(fēng)濕類中成藥非法添加對乙酰氨基酚進(jìn)行檢驗(yàn)。

目前有人使用高效液相色譜、質(zhì)譜對非法添加對乙酰氨基酚進(jìn)行檢驗(yàn)[1,2]，也有人嘗試使用薄層色譜對非法添加對乙酰氨基酚進(jìn)行快檢[3]，但尚無非法添加對乙酰氨基酚化學(xué)鑒別快速檢測方法的報(bào)道。

2.文獻(xiàn)調(diào)研

目前常用的快檢方法主要是近紅外、拉曼光譜、車載液相、等手段。目前常用的非法添加化學(xué)成分理化檢驗(yàn)快速篩查的方法具有類似的實(shí)施步驟：提取樣品中的目標(biāo)化學(xué)成分。消除基質(zhì)干擾，加入檢測劑，產(chǎn)生沉淀或顯色反應(yīng)，陽性結(jié)果為添加，陰性結(jié)果為未添加。

《中國藥典》2015年版二部[4]中，對乙酰氨基酚化學(xué)鑒別：（1）本品的水溶液加三氯化鐵試液，即顯藍(lán)紫色。（2）取本品約0.1g，加稀鹽酸5ml，置水浴中加熱40分鐘，放冷；取0.5ml，滴加亞硝酸鈉試液5滴，搖勻，用水3ml稀釋后，加堿性β-萘酚試液2ml，振搖，即顯紅色。對乙酰氨基酚片鑒別：（1）取本品的細(xì)粉適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚0.5g），用乙醇20ml分次研磨使對乙酰氨基酚溶解，濾過，合并濾液，蒸干，殘?jiān)諏σ阴０被禹?xiàng)下的鑒別（1）、（2）項(xiàng)試驗(yàn)，顯相同的反應(yīng)。

對乙酰氨基酚鑒別（1）的原理[5]為對乙酰氨基酚中的結(jié)構(gòu)中有酚羥基，遇三氯化鐵試液產(chǎn)生藍(lán)紫色絡(luò)合物。鑒別（2）的原理為對乙酰氨基酚在酸性介質(zhì)中水解后生成對氨基酚，滴加亞硝酸鈉試液，生成重氮鹽，再加堿性B-萘芬試液，生成紅色偶氮化合物。《藥品快速檢測技術(shù)研究與應(yīng)用》化藥卷[6]一書中也使用對乙酰氨基酚與三氯化鐵的顯色反應(yīng)來鑒別對乙酰氨基酚類藥品。

3.快檢方法設(shè)計(jì)與優(yōu)化

3.1 提取劑的選擇

對乙酰氨基酚在熱水或乙醇中易溶，在丙酮中溶解，在水中略溶。參考《藥品快速檢測技術(shù)研究與應(yīng)用》一書，對于膠囊、片劑、顆粒劑等固體制劑，使用氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）作為提取溶劑，取上清液，使用0.45um微孔濾頭過濾滴加檢測劑，液體制劑如澄清，不用另加提取劑，直接滴加檢測劑即可。如渾濁或顏色過深，可過濾或適當(dāng)稀釋后滴加檢測劑。膏體糖分高，粘稠，直接加入檢測劑效果不好（有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證），加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）振搖提取后靜置片刻，可分層，取上層（即氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）作為供試液即可。

3.2 檢測劑的選擇

對乙酰氨基酚結(jié)構(gòu)簡單，官能團(tuán)少，本次文獻(xiàn)調(diào)研沒有查閱到可借鑒的沉淀反應(yīng)，因此只能采用顯色反應(yīng)。《中國藥典》2015年版二部對乙酰氨基酚鑒別（2）需要在水浴中加熱40分鐘，快檢車難以提供必要的水浴設(shè)備，不適用于快檢。鑒別（1）反應(yīng)簡單，專屬性強(qiáng)，比較適合。因此，選用9%三氯化鐵水溶液作為檢測劑。

4.擬定的快檢方法

液體制劑（露、糖漿、溶液等）：取液體制劑樣品約1ml置試管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）1～2ml,充分振搖后靜置分層，吸取適量溶劑層液體，滴加9%三氯化鐵水溶液，如有藍(lán)色、藍(lán)黑色或黑色等顏色產(chǎn)生，則為可疑樣品；如無明顯變色或變?yōu)槠渌伾瑒t為陰性結(jié)果。對于比較澄清的液體，可直接滴加9%三氯化鐵水溶液檢測。

固體制劑（膠囊、片、丸、顆粒等）：膠囊取1粒內(nèi)容物，片劑取1片，丸劑取2丸，顆粒劑取約1克，研磨均勻：置10ml具塞比色管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）1～2ml，強(qiáng)力振搖混勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液置試管中，滴加9%三氯化鐵水溶液，如有藍(lán)色、藍(lán)黑色或黑色等顏色產(chǎn)生，則為可疑樣品；如無明顯變色或變?yōu)槠渌伾瑒t為陰性結(jié)果。

膏體：取膏劑藥品約1克置試管中，加入氯仿：甲醇：丙酮（9∶2∶1）1～2ml，充分振搖后靜置分層，吸取適量溶劑層液體，滴加9%三氯化鐵水溶液，如有藍(lán)色、藍(lán)黑色或黑色等顏色產(chǎn)生，則為可疑樣品；如無明顯變色或變?yōu)槠渌伾瑒t為陰性結(jié)果。

5.快檢方法驗(yàn)證

項(xiàng)目組在零售藥店收集31批不同廠家的抗風(fēng)濕類中成藥：（1.強(qiáng)力天麻杜仲膠囊，2.風(fēng)濕安泰片①，3.骨松寶膠囊，4.復(fù)方風(fēng)濕寧片,5.壯骨關(guān)節(jié)丸，6.骨仙片，7.腰痛寧膠囊，8.盤龍七片，9.正清風(fēng)痛寧片，10.云南紅藥膠囊，11.萬通筋骨片，12.小活絡(luò)丸，13.復(fù)方夏天無片，14.獨(dú)一味膠囊，15.追風(fēng)透骨丸，16.天麻片，17.金烏骨通膠囊，18舒筋丸,19.抗骨增生片，20.舒筋活血片，21.伸筋丹膠囊，22.腰息痛膠囊，23. 腰痛片，24.強(qiáng)力天麻杜仲丸，25.風(fēng)濕安泰片②，26.漢桃葉片，27.抗骨質(zhì)增生丸，28.獨(dú)一味顆粒，29.風(fēng)痛片，30.骨盤丸膠囊，31.維C銀翹片）。

采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-QTOF）確證樣品是否存在非法添加。由于收集到的含有對乙酰氨基酚的樣品較少，對于未添加對乙酰氨基酚而且快檢成陰性的樣品，采用了添加約20mg對乙酰氨基酚對照品的方法模擬非法添加。添加時(shí)使用研磨、超聲等方法使對照品和樣品混合均勻。

液質(zhì)聯(lián)用驗(yàn)證方法

對于樣品是否存在非法添加，使用液質(zhì)聯(lián)用檢驗(yàn)（LC-QTOF）作為最終確證方法，實(shí)驗(yàn)條件如下：

色譜條件：Agilent1200RRLC高效液相

色譜柱： Agilent ZORBAX EclipsePlus,C18,最高耐受600bar，3.0*100mm

填料粒徑：1.8um Serial Number∶USWHH01323

柱溫：45℃ 流動(dòng)性：水相：5mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸有機(jī)相：甲醇

梯度洗脫條件：如下表。

表

質(zhì)譜條件：

Agilent四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（QTOF6538），ESI源，干燥氣溫度；320℃，干燥氣流速：10L/min，霧化器壓力：40psi，fragmentor∶135V,VCap∶4000, 參比霧化器壓力：5 psi，選用121和922作為參比離子實(shí)時(shí)校正。選用Targeted ms/ms模式，采用碎片離子和保留時(shí)間作為定向依據(jù)。

對照品溶液的制備：取對乙酰氨基酚對照品約10mg，置100ml量瓶中，緊密稱定，加純水溶解并定容至刻度，搖勻，得到每1ml含對乙酰氨基酚約100ug的對照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品膠囊5粒內(nèi)容物混勻，取約1粒內(nèi)容物重量（膏、露、口服溶液、糖漿、顆粒制劑取約1g，片劑取1片，丸劑取3丸），置100ml量瓶中，精密稱定，加水適量，超聲10分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

測定法：分別取對照品溶液和供試品溶液各3ul，依次注入液相色譜儀，記錄質(zhì)譜總離子流（TIC），一級質(zhì)譜按質(zhì)核比提取對乙酰氨基酚準(zhǔn)分子離子的離子流（EIC），二級質(zhì)譜選用Targated ms/ms模式，采用碎片離子和保留時(shí)間作為定性依據(jù)。

6.結(jié)果分析

31批樣品中，22,31共2批樣品標(biāo)示含有對乙酰氨基酚，快檢結(jié)果顯陽性。10、23樣品未標(biāo)示含有對乙酰氨基酚，液質(zhì)結(jié)果未檢出對乙酰氨基酚，快檢呈陽性。其余27批樣品液質(zhì)結(jié)果未添加對乙酰氨基酚，快檢成陰性，添加對乙酰氨基酚對照品后，快檢結(jié)果均呈陽性。

以上結(jié)果表明（1）對于添加了對乙酰氨基酚的樣品（包括添加對乙酰氨基酚對照品的樣品），該快檢方法均能檢驗(yàn)未陽性，陽性檢出率為100%，假陰性為0%。（2）對于未添加對乙酰氨基酚的樣品，有10、23二批被快檢為陽性，其余27批均被檢出為陰性，真陰性率為93.1%，假陽性率為6.9%。

檢測靈敏度：取濃度約為100ug/ml的對乙酰氨基酚水溶液約1ml，滴加9%三氯化鐵水溶液，結(jié)果上層液有藍(lán)色產(chǎn)生，表明對于對乙酰氨基酚，該方法的檢測靈敏度可達(dá)到0.1mg。

[1]來國服,程斌,魯靜.LC-MS法測定抗風(fēng)濕類中藥非法添加化學(xué)藥物成分[J].中國藥師,2013,13（4）：453-455.

[2]吳小紅，李煥德，吳高芬,等.HPLC-DAD法同時(shí)測定部分中成藥及保健食品中添加的9種解熱鎮(zhèn)痛藥物[J].藥物分析雜志,2010,30（10）1865-1868.

[3]張鶴，黃子桐，朱禹彭,等.關(guān)于抗風(fēng)濕類中藥制劑中非法添加化學(xué)藥品 的檢測方法研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2010,6（6）：31-32.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2015年版二部，中國醫(yī)藥科技出版社，2015：234-235.

[5]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典1990年版二部藥典注釋，化學(xué)工業(yè)出版社，1990：182-184.

[6]邊振甲，李云龍，金少鴻,等.藥品快速檢測技術(shù)研究與應(yīng)用化藥卷[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2013：1061-1070.