枯草芽孢桿菌與產朊假絲酵母發酵豆粕的酶活力測定

曾亞桐，張 怡，朱秋菊，童應凱

(天津農學院農學與資源環境生物技術系 天津300384)

0 引 言

隨著人們生活水平的提高，人們對生活質量的提升要求迫切。豆粕是畜牧養殖業行業需求量相當大的蛋白原料。豆粕中的粗蛋白含量達到 43%～48%，而且由相對平衡的氨基酸組成，賴氨酸達 2.3%～2.5%[1]。但是相對于動物蛋白來講，豆粕中的蛋白質含量較低，并且含有較多的抗營養因子，不利于動物消化吸收，從而影響豆粕的利用效率[2]。通過微生物混合發酵，將豆粕中的粗蛋白分解成小肽，可以大幅度提高豆粕的利用率。

枯草芽孢桿菌可產生大量的蛋白酶、淀粉酶等活性較高的酶，能夠較好地水解大豆蛋白并降解豆粕中抗營養因子。芽孢桿菌有不易致死的芽孢，能夠以活菌的狀態進入動物腸道抑制有害菌的生長[3]。產朊假絲酵母可以分泌多種水解酶，有助于提高豆粕中蛋白含量，同時降低抗營養因子含量。通過枯草芽孢桿菌與產朊假絲酵母協同發酵，嚴格控制料水比，進行厭氧發酵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌與產朊假絲酵母均為天津農學院生物技術系微生物實驗室保存菌種，于2017年 9月獲得。

1.1.2 培養基

菌種培養基：枯草芽孢桿菌——肉湯培養基產朊假絲酵母——YEPD固體培養基。

樣品培養基：豆粕、微量元素、蒸餾水按照5∶1∶5的比例配置固體培養基，于 121,℃滅菌20,min。

1.1.3 其他藥品

微量元素配比，硫酸鎂、葡萄糖、磷酸二氫鉀按照100,mL中0.001%∶0.1%∶0.5%,進行調配。

淀粉酶活力和糖化酶活力測定所需藥品：pH值為 6.9磷酸鈉緩沖液、1%,淀粉溶液、3，5-二硝基水楊酸顯色劑、麥芽糖標準液。

蛋白酶活力測定所需藥品：pH值為 3.5乳酸緩沖液、pH值為 7.0磷酸緩沖液、pH值為 9.9碳酸緩沖液、1%,干酪素、0.4,mol/L三氯乙酸、Folin試劑、0.4,mol/L碳酸鈉。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的準備

各取一環枯草芽孢桿菌和產朊假絲酵母分別接種到肉湯固體培養基和 YEPD固體培養基上，并分別置于32,℃培養72,h。

1.2.2 樣品的制備

將培養好的菌種制成菌懸液，每 10,g培養基中接種0.5,mL菌懸液，隔12,h取一次樣測其酶活力。

樣品1：加入0.5,mL枯草芽孢桿菌菌懸液；

樣品2：加入0.5,mL產朊假絲酵母菌懸液；

樣品3：加入 0.25,mL枯草芽孢桿菌菌懸液和0.25,mL產朊假絲酵母菌懸液。

1.2.3 糖化酶活力和淀粉酶活力的測定

1.2.3.1 樣品處理

分別稱取1,g樣品1、2、3放于離心管中并標記，每管加入 20,mL、pH值為 6.9磷酸鈉緩沖液，3,000,r/min離心10,min，取上清液。

1.2.3.2 淀粉酶測定步驟

取7支試管，按照表1操作。

表1 淀粉酶活力測定方法Tab.1 Amylase activity assay method

1.2.3.3α-淀粉酶活力的測定

將提取酶液置于 70,℃水浴加熱 15,min鈍化 β-淀粉酶后，按照表1進行操作。

1.2.4 蛋白酶活力測定

1.2.4.1 樣品處理

樣品1、2、3各稱取3份1,g樣品置于離心管中，用于檢測3種樣品的酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力、堿性蛋白酶活力。酸性蛋白酶檢測樣品中加入20,mL、pH 值為 3.5的乳酸緩沖液，于 40,℃水浴0.5,h；中性蛋白酶檢測樣品中加入 20,mL、pH 值為7.0磷酸鹽緩沖液，于30,℃水浴0.5,h；堿性蛋白酶檢測樣品中加入20,mL、pH值為9.9的碳酸鹽緩沖液，于 22,℃水浴 0.5,h。處理后樣品3,000,r/min離心10,min，分別取上清液[4-5]。

1.2.4.2 測定步驟

分別取 1,mL待測酶液于樣品管中，相應溫度預熱 5,min，加入相應溫度的 1%,干酪素 1,mL，并于相應溫度反應20,min。迅速取出加入2,mL 0.4,mol/L的三氯乙酸終止反應，沉淀過量底物10,min過濾，取反應液1,mL，加入5,mL 0.4,mol/L的碳酸鈉溶液，加入1,mL 福林-酚試劑，搖勻，40,℃水浴 20,min，在660,nm波長下比色并記錄。

空白測定，另取一空白管，加入 2,mL 0.4,mol/L的三氯乙酸，再加入1,mL 2%,酪蛋白溶液，40,℃沉淀完全后加入1,mL酶液，其余操作同上，得空白A660[6]。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶活力測定結果

2.1.1 干酪素標準曲線

以干酪素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制得干酪素標準曲線，計算出樣品中蛋白酶含量，標準曲線結果如圖1所示。

圖1 干酪素標準曲線Fig.1 Casein standard curve

2.1.2 堿性蛋白酶活力測定結果

測定3種樣品的堿性蛋白酶活力，從而得出添加不同菌種對發酵體系堿性蛋白酶活力的影響，其測定結果如圖2所示。

圖2 堿性蛋白酶活力Fig.2 Alkaline protease activity

圖2 中產朊假絲酵母發酵豆粕的堿性蛋白酶活力相對于其他兩組最小，前 36,h比較平穩，36～48,h酶活力開始上升，由于微生物大量繁殖產生大量CO2，抑制酵母生長，48～60,h酶活力降低，60,h后無氧呼吸產生的丙酮酸與 CO2結合生成草酰乙酸，促進蛋白酶活性增長，72,h上升至最大值 314.4,μg/g；枯草芽孢桿菌單菌發酵前 36,h一直處于上升趨勢，由于微生物生長繁殖產生大量CO2，抑制細菌繼續生長甚至部分細菌死亡，36,h后酶活力下降，48,h后CO2促進中間體的合成酶活力又開始上升，72,h后酶活力達最大值 498,μg/g；混合菌種發酵從發酵開始酶活力一直處于上升趨勢，發酵 60,h酶活力達到最大值726,μg /g后開始降低。綜上所述，混合菌種發酵豆粕的堿性蛋白酶活力最強。

2.1.3 中性蛋白酶活力測定結果

測定3種樣品的中性蛋白酶活力，判斷添加不同菌種對發酵體系中性蛋白酶活力的影響，其測定結果如圖3所示。

圖3 中性蛋白酶活力Fig.3 Neutral protease activity

由圖3可以看出產朊假絲酵母發酵豆粕前 24,h酵母大量增殖，中性蛋白酶活力處于上升趨勢，24,h后 CO2濃度增加，抑制菌體生長酶活力開始下降，60,h后其他酶水解底物提供大量能量和前體，促進蛋白酶合成，酶活力上升，72,h達到最大值235.2,μg/g；枯草芽孢桿菌發酵前 48,h細菌進行大量增殖，酶活性為上升狀態且達到最大值 385.2,μg/g，48,h后 CO2濃度增加，抑制細菌增長酶活力開始下降；混合菌種發酵從總體上來看一直處于上升狀態，酶活力在24～36,h下降后又開始上升。總體來講，3組發酵中混合菌種發酵效果較兩種單菌發酵效果更明顯，且酶活性值最大。

2.1.4 酸性蛋白酶活力測定

測定3種樣品的酸性蛋白酶活力，判斷添加不同菌種對發酵體系酸性蛋白酶活力的影響，其測定結果如圖4所示。

圖4 酸性蛋白酶活力Fig.4 Acid protease activity

由圖4可知，枯草芽孢桿菌發酵豆粕一直呈上升狀態，前48,h酸性蛋白酶活力增長緩慢，48,h后酶活力上升趨勢明顯；產朊假絲酵母發酵 24,h前酶活力逐漸降低，24,h后開始上升至 48,h最大值391.2,μg/g，然后開始急劇下降，可能是由于酵母增長繁殖，產生熱量，培養基溫度高于外界恒定培養溫度，導致大部分菌體死亡；混合菌種發酵前24,h酶活力呈上升趨勢，24～60,h由于菌體大量增殖釋放CO2和熱量，抑制菌體生長，酶活力迅速降低，60,h后可能因為其他酶的協同作用，促進蛋白酶活力上升，72,h達到最高點 440.4,μg/g。總體來說，雖然混合菌種發酵波動較大，但是混合菌種發酵兩次達到相對最大值，所以混合菌種發酵豆粕產酸性蛋白酶活力表現較好。

2.2 糖化酶活力測定結果

2.2.1 麥芽糖標準曲線

以麥芽糖濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度(Abs)為縱坐標，麥芽糖標準曲線用于糖化酶和淀粉酶含量的測定，結果如圖5所示。

2.2.2 糖化酶活性

以 3，5-二硝基水楊酸為顯色劑紫外分光光度法測定3種樣品的糖化酶活力，結果如圖6所示。

圖6 糖化酶活力Fig.6 Glucoamylase activity

由圖6可知，產朊假絲酵母發酵豆柏糖化酶活力隨時間的增加酶活性逐漸升高，48,h之后酶活性增長平緩。枯草芽孢桿菌發酵豆粕，前36,h大量增殖酶活力逐漸上升，36,h后CO2抑制細菌的生長，酶活性開始降低，60,h大量的CO2促進草酰氨乙酸合成，酶活力上升，72,h達到最大值 779.596 6,U/mg；混合菌種發酵豆粕前24,h糖化酶活性上升，菌種大量增殖，產生CO2，24～48,h進行無氧呼吸，細菌中PEP羧化酶和酵母中丙酮酸羧化酶與 CO2結合，生成大量草酰乙酸，促進氨基酸前體與蛋白質合成[7]，60,h糖化酶活性達到最大值 806.646 7,U/mg。綜上所述，混合菌種發酵豆粕的糖化酶活力最強。

2.2.3 α-淀粉酶活性的測定

測定 3種樣品的 α-淀粉酶活力，判斷添加不同菌種對發酵體系α-淀粉酶活力的影響，其測定結果如圖7所示。

圖7α-淀粉酶活力Fig.7 Alpha-amylase activity

由圖7可知，枯草芽孢桿菌發酵期間，36～60,hα-淀粉酶活性最低，可能是因為菌體增殖后產生的CO2和熱量影響了蛋白酶酶活性，60,h后酶活性增強，可能是其他酶的協同作用，在 72,h達到最大值；產朊假絲酵母發酵期間，前36,h酶活力迅速上升，酵母大量增殖，36～72,h酶活力上升緩慢并在 72,h達到最大值748.560 2,U/g；混合菌種發酵期間，前36,h酶活力上升緩慢，在 24,h和 60,h都出現高峰值，36～48,h酶活力減弱，可能是由于細胞呼吸作用產生大量 CO2和熱量，抑制了細胞的生長，48～60,h酶活力增強，可能是因為細胞中 NH4+與培養基中 K+結合，激活α-淀粉酶[7-8]，24,h達到最大值 762.84,U/g，整體高于2種單菌發酵值，說明枯草芽孢桿菌產生的α-淀粉酶活力增強了產朊假絲酵母的α-淀粉酶活力。

2.2.4 β-淀粉酶活力測定

計算 3種樣品的 β-淀粉酶活力，判斷添加不同菌種對發酵體系β-淀粉酶活力的影響，其結果如圖8所示。

圖8 β-淀粉酶活力Fig.8 β-amylase activity

由圖8可知，枯草芽孢桿菌發酵前 24,h迅速上升至酶活力最大值 32.063 5,U/g，24～48,h酶活力下降，48～60,h上升后再次下降；產朊假絲酵母發酵在12,h下降，36,h上升，48,h后下降，60,h后酶活力趨近于平穩；混合菌種發酵在 24,h酶活力達到最大值49.225 1,U/g后開始下降，60,h后上升。枯草芽孢桿菌與產朊假絲酵母單菌發酵，酶活性都出現了上升后下降再上升的走勢，第一次酶活力降低可能由于細胞增殖產熱，抑制菌體生長，第二次酶活力增強可能是培養基內的Mg2+增強了β-淀粉酶活力[8]。綜合來講，混合菌種發酵酶活力相對最強。

3 討 論

①豆粕主要以粗蛋白為主。所以發酵豆粕要以降解粗蛋白為主要目的，通過對蛋白酶活力測定，可以確定降解粗蛋白的時間。混合菌種發酵 60～72,h之間蛋白酶活性比較強。

除了粗蛋白，豆粕中含有一定的糖類物質，通過對淀粉酶活力的測定，混合菌種發酵 24,h淀粉酶活性比較強。綜合比較發現，混菌發酵體系中，糖類物質會先一步被分解，然后再逐步分解蛋白質。

②枯草芽孢桿菌中有 PEP羧化酶，而產朊假絲酵母有丙酮酸羧化酶，二者均可以與 CO2結合產生草酰乙酸，促進氨基酸代謝，從而促進胞內蛋白的合成，所以混合發酵中枯草芽孢桿菌對產朊假絲酵母發酵具有協同作用。

4 結 論

在一定培養時間范圍內，枯草芽孢桿菌與產朊假絲酵母混合發酵具有協同作用，通過分別測定蛋白酶和糖化酶活力，顯示枯草芽孢桿菌與產朊假絲酵母混合菌種發酵效果最好，發酵 60～72,h其蛋白酶活力最高，發酵24,h其淀粉酶活力最高。