牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白性質比較

夏儷寧,賈 慧,李 琦,徐 暢,董秀萍,潘錦鋒

(大連工業大學食品學院 國家海洋食品工程技術研究中心 遼寧大連 116034)

牙鲆魚(Paralichthysolivaceus),別名鲆魚,為硬骨魚綱、鲆科,是比目魚的一類。多寶魚,學名大菱鲆(Psettamaxima),為硬骨魚綱鰈形目鲆科菱鲆屬海洋底棲魚類。以上兩種魚都屬鲆魚類,因肉質白嫩、鮮美可口受到消費者的喜愛。2016年我國鲆魚產量為11.8萬噸[1]。

魚肉是一種優質的食物資源,蛋白含量高、脂肪含量低,且所含脂肪多為不飽和脂肪酸[2-3],營養價值高。魚肉及魚肉制品呈現的結構、形態、色澤、香氣、味道等性質,主要取決于各種魚肉蛋白的功能性質在制備、加工或保藏中的理化性質的變化[4-5]。肌肉組織蛋白質通常可分為三類:肌原纖維蛋白(收縮性蛋白)、肌漿蛋白(代謝性蛋白)、基質蛋白(結締組織蛋白)。肌原纖維蛋白是肌肉中最重要的蛋白質,又稱為鹽溶性蛋白,約占總蛋白的50%～55%,由肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白和調節蛋白(原肌球蛋白、肌鈣蛋白)等組成[6]。

肌原纖維是魚肉的基本組成單位,研究表明魚肉的許多加工特性與肌原纖維的特性息息相關。在魚肉加工保藏過程中,肌原纖維結構與理化性質發生變化,導致魚肉嫩度﹑保水性﹑膠凝性等發生改變[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牙鲆魚815±5 g、多寶魚887±5 g 購于大連市美林園農貿市場,活運至實驗室。

Ca2+超微量ATP酶測試盒 南京建成生物工程研究所;改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒 上海生工生物工程有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 上海生工生物工程有限公司;金龍魚一級大豆油 益海嘉里食品營銷有限公司;順丁烯二酸 國藥集團化學試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、BBI Life Sciences、氯化鉀等試劑 均為分析純。

Discovery HR-1流變儀 美國TA公司;μDSC微量熱儀 法國SETARAM公司;Infinite200 NANO酶標定量測定儀 瑞士TECAN公司;UV-5200型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;AE-6401垂直電泳儀槽 日本ATTO。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質的提取分離 鮮活牙鲆魚、多寶魚冰水致死后宰殺去皮去刺,取背部肌肉,將其切成魚塊(2 cm×2 cm×2 cm),置于碎肉機中,制成肉糜,放于自封袋中,于-30 ℃凍存,6個月內用完。將肉糜加入5倍體積冰冷(4 ℃)的洗液0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate(pH7.0)緩沖液作勻漿處理。高速均質3次,每次30 s,間隔20 s置于冰盒中,在10000×g、4 ℃條件下離心10 min,取沉淀,上清液為肌漿蛋白。在沉淀中加入5倍體積的0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate(pH7.0)緩沖液,再次高速均質3次,每次30 s,間隔20 s置于冰盒中,10000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,取上清液即為肌原纖維蛋白。采用 Bradford 法測定蛋白質濃度[8]。

1.2.2 肌肉蛋白形式測定

1.2.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳 樣品制備:將牙鲆魚與多寶魚肌漿蛋白、肌原纖維蛋白溶液調整質量濃度為7 mg/mL,采用10%分離膠,5%濃縮膠。以體積比為1∶1混合蛋白液與5×上樣緩沖液,沸水浴5 min。進行SDS-PAGE凝膠電泳,以對比牙鲆魚與多寶魚的肌漿蛋白、肌原纖維蛋白的區別。

用ATTO 垂直電泳儀,電極緩沖液采用SDS-Tris-甘氨酸系統,15 mA/膠恒電流電泳直至溴酚藍前沿離凝膠下端1 cm左右時結束。考馬斯亮藍-乙酸-甲醇溶液振蕩染色過夜,去離子水沖洗,再用SDS-PAGE脫色液(50%的乙醇,9%的冰乙酸)脫色,直至條帶清晰。最后用Bio-lmaging Systems MF-ChemBIS 2.0的凝膠成像儀(UV板)成像。

1.2.2.2 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性測定 將1.2.1提取的肌原纖維蛋白濃度調整至4 mg/mL,采用Ca2+超微量ATP酶測試盒進行測定。

我院中心藥房麻精藥品智能化管理系統的開發與應用…………………………………………………… 沈國榮等（9）：1158

1.2.3 肌原纖維蛋白熱特性

1.2.3.1 差示掃描量熱法(DSC)分析 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,準確稱取樣品(170±0.1 mg),置于氧化鋁密封坩堝中,密封,在氮氣保護下將氧化鋁密封坩堝置于差式掃描量熱儀中。從10 ℃開始,以1 K/min升溫至70 ℃,得到牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白的DSC譜圖。

1.2.3.2 動態流變學 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,采用平行板直徑為50 mm 的流變儀進行測定,分別將5 mg/mL的牙鲆魚肌原纖維蛋白溶液及5 mg/mL的多寶魚肌原纖維蛋白溶液上樣于兩個平板之間,調節板間的距離為 0.5 mm,除去四周過量的樣品。實驗條件:常應變率1 rads-1,擺動幅度1%,溫度掃描以2.0 ℃/min的速率從20 ℃開始升溫至80 ℃,隨后降至25 ℃。

1.2.4 肌原纖維蛋白功能特性

1.2.4.1 乳化性的測定 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,調節肌原纖維蛋白濃度至5、10、20 mg/mL,取3 mL蛋白液與10 mL大豆油混合,18000 r/min高速勻漿1 min制成乳狀液,立即于容器底部取樣50 μL,用0.1% SDS 溶液稀釋100倍,劇烈振蕩10 s后在波長500 nm處測定吸光值A,以同濃度SDS 溶液作空白[9]。室溫放置10 min后再次取樣測定。每一式樣測定三次取平均值[10]。

其中乳化活性(Emulsifying Activity Index,EAI)和乳化穩定性(Emulsion Stability Index,ESI)計算公式:

EAI(m2/g)=(2×2.303×dil×A)/(C×φ×10000)

式中:dil-稀釋倍數;A-乳化液吸光值;C-樣品質量濃度(g/mL);φ-乳化液中油相比例(0.25)。

ESI(min)=(A0×10)/(A0-A10)

式中:A0-初始乳化液吸光值;A10-10 min后吸光值。

1.2.4.2 起泡性的測定 取1.2.1方法制備的蛋白溶液,調節肌原纖維蛋白濃度至1、2、5 mg/mL,置于室溫20 min。取15 mL,室溫下16000 r/min高速勻漿1 min。隨后將溶液體系轉移至25 mL量筒,計體積數A[11]。

其中起泡性(Foaming capacity,FC)和起泡穩定性(Foaming stability,FS)計算公式:

FC(%)=(VT/V0)×100

式中:VT-勻漿后總體積(mL);V0-勻漿前原始體積(mL)。

勻漿后體系室溫下放置5 min后再次量取體積。

FS(%)=(Vt/V0)×100

式中:Vt-勻漿后室溫下靜置5 min后體積(mL);V0-勻漿前原始體積(mL)。

1.2.5 數據統計與分析 實驗數據用SPSS 16.0軟件處理分析,數據以平均值(average value,AV)±標準誤差(standard error,SE)形式表示,采用單因素方差法分析數據,進一步以Duncan法進行多組平均數的差異水平分析,顯著性水平設定為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳

如圖1所示,A、B為7 mg/mL牙鲆魚、多寶魚的肌漿蛋白電泳圖譜。本研究發現在66.4～44.3 kDa條帶群中多寶魚較牙鲆魚多一條特異條帶。在20.1～44.3 kDa間牙鲆魚肌漿蛋白中較多寶魚肌漿蛋白多兩條較特異條帶。該結果與蔡揚鵬等人對幾種魚肌肉蛋白的研究結果有明顯差異[12]:鯉魚在15.9 kDa處有一特異條帶,草魚則在41.1和35.9 kDa處有特異條帶。C、D為7 mg/mL牙鲆魚、多寶魚的肌原纖維蛋白電泳圖譜,與蔡揚鵬等人研究結果相似[12],牙鲆魚與多寶魚均在200 kDa處都有一個明顯的條帶,為肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC),而在44.3 kDa左右也有明顯的條帶,為肌動蛋白。66.4 kDa處牙鲆魚較多寶魚多一條特異條帶。牙鲆魚與多寶魚中肌漿蛋白以及肌原纖維蛋白特異條帶的差別有助于種類的鑒別。

圖1 牙鲆魚、多寶魚肌肉蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of flounder and turbot muscle proteins注：H:High Marker;L:Low Marker;A:多寶魚肌漿蛋白;B:牙鲆魚肌漿蛋白;C:多寶魚肌原纖維蛋白;D:牙鲆魚肌原纖維蛋白。

2.2 肌原纖維蛋白中Ca2+-ATPase活性

肌球蛋白是魚肌肉中最豐富也是最重要的蛋白質,肌原纖維蛋白的性質主要是由肌球蛋白的性質決定[13]。肌球蛋白的球狀頭部具有ATPase的活性,則在測定魚肌肉蛋白質變性時通常以肌球蛋白ATPase的活性作為指標。如圖2所示牙鲆魚肌原纖維蛋白中Ca2+-ATPase活性要高于多寶魚,與Watabe等報道的棲息于較高環境溫度下的魚一般具有更高的肌球蛋白Ca2+-ATPase活性結論相符合[14]。

圖2 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性Fig.2 Ca2+-ATPase of myofibrillar protein of flounder and turbot

2.3 肌原纖維蛋白DSC分析

差示掃描量熱分析(DSC)是評價蛋白結構變化的重要指標。肌原纖維蛋白質在加熱過程中會發生變性和聚集,引起一系列理化特性的變化進而造成產品性質的變化[15]。熱轉化溫度(Tm)反映了蛋白質變性導致其立體結構解離的溫度,其值與被測蛋白質的結構性質有關。圖3是牙鲆魚、多寶魚兩種鲆類魚的肌原纖維蛋白的DSC分析圖譜。多寶魚肌原纖維蛋白的Tm值(39.98 ℃)高于牙鲆魚肌原纖維蛋白的Tm值(37.86 ℃)。根據魯長新研究表明,該溫度出現峰值可能與肌球蛋白有關,二者Tm的差異可能是由于肌球蛋白頭部和尾部熱穩定性不同導致的[16]。邵穎等報道了幾種魚的熱轉化溫度Tm,其中武昌魚(44.03 ℃)、鱸魚(44.93 ℃)、草魚(45.67 ℃),均高于多寶魚,而鱖魚(39.33 ℃)與多寶魚相當[17]。與邵穎等人研究結果的差異,可能是由于魚種類及地理環境的不同所導致的。

圖3 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白DSC曲線Fig.3 DSC heating curve for flounder and turbot myofibrillar protein

2.4 流變特性分析

對牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白在溫度從20～80 ℃的流變性變化進行了測定,結果如圖4所示。所有的樣品中在加熱前其儲藏模量(Storage modulus,G′,或彈性模量)均高于損耗模量(Loss modulus,G″,或粘性模量),表明處理的肌原纖維蛋白體系已經具有凝膠樣結構[18-19]。對比牙鲆魚與多寶魚,牙鲆魚與多寶魚的G′在40～50 ℃間有一交叉點,隨后隨著溫度的升高,牙鲆魚的儲藏模量G′高于多寶魚,主要是由于蛋白質在加熱變性的過程中產生的肌動球蛋白之間的交聯,形成的共價鍵和非共價鍵限制了蛋白質分子的運動造成的[20]。同時對于損耗模量G″牙鲆魚在40～50 ℃之間有一個峰,此處為一個流變特性轉折點。多寶魚在50～60 ℃有一個流變特性轉折點。損耗模量G″流變特性轉折點與DSC的熱轉化溫度點一致。

圖4 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白動態流變學特性變化Fig.4 Rheological properties for myofibrillar protein of flounder and turbot

2.5 肌原纖維蛋白特性

2.5.1 乳化性 乳化性是蛋白質重要的功能性質之一,主要包括乳化活性指數(Emulsifying Activity Index,EAI)和乳化穩定系數(Emulsifying Stability Index,ESI)[21-22]。魚肉蛋白質的乳化能力以及其乳狀液可由其在500 nm處的吸光度值表示。圖5為牙鲆魚與多寶魚在不同濃度下魚肉肌原纖維蛋白的乳化活性。由圖5可以看出,蛋白乳化活性隨著蛋白濃度的提高而逐漸降低。在低濃度(5 mg/mL)處,牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化活性6.76 m2/g高于多寶魚5.92 m2/g,而在中濃度(10 mg/mL)處,牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化活性3.72 m2/g低于多寶魚4.16 m2/g。本實驗乳化性的結果是與顧振宇等人的研究結果有一定的差別[23]。這可能是因為實驗選擇原料差異所導致的。由于較大的蛋白聚集體產生,而不能再形成穩定的界膜,因此EAI值降低。

圖5 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白乳化活性Fig.5 EAI of flounder and turbot myofibrillar protein

蛋白質的乳化穩定性代表蛋白質與脂肪小球結合的能力的變化情況,隨著時間的增加,被粉碎的小的脂肪球將會開始慢慢聚集形成大的脂肪球,乳化能力降低,使吸光度變小,因此可以通過吸光度的變化來考察蛋白質的穩定性[24]。圖6為牙鲆魚與多寶魚在不同濃度下魚肉肌原纖維蛋白的乳化穩定性。由圖6可以看出,蛋白乳化穩定性隨著濃度的上升變化趨勢是降低的。在低濃度(5 mg/mL)與中濃度(10 mg/mL)處牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化穩定性高于多寶魚,而在高濃度(20 mg/mL)處牙鲆魚肌原纖維蛋白乳化穩定性低于多寶魚。勻漿會使原來分散的蛋白空間結構發生改變,蛋白變性程度增大,使其乳化穩定性降低。

圖6 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白乳化穩定性Fig.6 ESI of protein of flounder and turbot myofibrillar protein

2.5.2 起泡性 魚蛋白質高分子溶液經攪打而產生泡沫的性質稱為蛋白質高分子的起泡性質,包括起泡能力(Foaming Capacity,FC)和起泡穩定性(Foaming Stability,FS)。由圖7可以看出,肌原纖維蛋白起泡性質總體變化趨勢是升高的。如圖7,低濃度(1 mg/mL)時牙鲆魚肌原纖維蛋白起泡性低于多寶魚,中濃度(2 mg/mL)與高濃度(5 mg/mL)時高于多寶魚。同時隨著濃度的升高,多寶魚起泡性趨于平緩。本實驗起泡性的結果是與郭浩楠等人的研究結果相似[25]。

圖7 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白起泡特性Fig.7 FC of flounder and turbot myofibrillar protein

由圖8可以看出,牙鲆魚肌原纖維蛋白起泡穩定性趨于平穩,而多寶魚肌原纖維蛋白起泡穩定性呈現降低的趨勢。隨著蛋白濃度的提高,分子間相互作用形成了穩定網絡結構和界面膜遭到破壞,產生的泡沫界面膜易破裂,因而起泡性和泡沫穩定性降低[26]。如圖8,低濃度(1 mg/mL)時多寶魚的肌原纖維蛋白起泡穩定性高于牙鲆魚肌原纖維蛋白,高濃度(5 mg/mL)時牙鲆魚的肌原纖維蛋白起泡穩定性高于多寶魚肌原纖維蛋白。中濃度(2 mg/mL)時二者蛋白起泡穩定性相似。

圖8 牙鲆魚、多寶魚肌原纖維蛋白起泡穩定性Fig.8 FS of flounder and turbot myofibrillar protein

3 結論

牙鲆魚與多寶魚水溶性蛋白,牙鲆魚較多寶魚具有特異條帶;而在鹽溶性蛋白中,多寶魚肌球蛋白重鏈多于牙鲆魚。在流變特性中多寶魚肌原纖維蛋白變性溫度高于牙鲆魚,損耗模量G″流變特性轉折點與DSC的熱轉化溫度點一致。低濃度時牙鲆魚乳化活性高于多寶魚,中、高濃度時二者的乳化活性差異不顯著。低濃度牙鲆魚肌原纖維蛋白起泡性低于多寶魚,中與高濃度時高于多寶魚。同時隨著濃度的升高,多寶魚起泡性趨于穩定。以上結果證實,雖皆為鲆鰈類冷水魚,牙鲆魚與多寶魚肌原纖維蛋白的蛋白形式、流變特性、乳化特性以及起泡性等功能特性有一定差異。實際生產過程中應合理設計加工條件與工藝,實現對牙鲆魚和多寶魚魚肉蛋白資源的合理利用與產品開發。