不同貯藏年份蜜蘭香型嶺頭單叢茶 抗氧化成分及抗氧化活性的影響

陳荷霞,傅 力,李 云

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 8300522;2.韓山師范學院食品工程與生物科技學院,廣東潮州 521041)

嶺頭單叢茶是廣東省烏龍茶的主要名優茶,具有香氣清高持久,滋味濃醇甘爽,蜜味甜潤的特點。烏龍茶對人體有多方面的保健和藥理作用,如降血脂[1],降膽固醇[2],防癌抗癌[3]和抗氧化[4]等功效。其中兒茶素、酚酸、黃酮以及其他黃酮衍生物是茶葉清除自由基、實現其抗氧化及保健作用的物質基礎,茶葉中茶多酚含量與其自由基的清除能力呈現良好的量效關系[5]。研究報道氨基酸和咖啡堿具有較高的抗氧化活性,是潛在的抗氧化物質資源[6],茶色素也具有清除自由基的能力[7]。目前對單叢茶活性成分和抗氧化作用的研究主要集中在鳳凰單叢茶,蘇新國[8]等人研究表明鳳凰單叢茶水浸出物中的茶多酚、茶黃素和茶紅素等含量較高,同時表現出較高的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基,超氧陰離子和羥基自由基清除能力。Suetal[9]認為,鳳凰單叢茶水提取液清除 DPPH自由基 的性能與多酚類含量密切相關。鄭善元[10]等人分析認為單叢茶水提物抗氧化活性強,清除ABTS(2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)自由基的效果明顯高于清除DPPH自由基的效果。國內對嶺頭單叢茶的研究主要集中在加工技術[11]、種質鑒定[12]、品質化學特性[13-15]、加工過程中香氣成分變化[16]和做青工藝[17]的研究。關于貯藏年份對嶺頭單叢茶抗氧化活性成分含量及其抗氧化活性影響的研究鮮見報道。本文對貯藏5年、10年、15年、20年和2016年(對照)制作的蜜蘭香型嶺頭單叢茶中的茶多酚、黃酮、游離氨基酸、茶黃素、兒茶素和咖啡堿的含量進行測定,并測定不同貯藏年份單叢茶水提物對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力、對超氧陰離子的抑制能力及還原能力,為陳香嶺頭單叢茶新產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

茶青 均采于海拔1000 m左右的茶樹,茶樹種植管理方式相同,茶樣均按照張博[11]的加工工藝制作,用鋁箔封口袋密封,于室溫保藏;貯藏5、10、15、20年的蜜蘭香型嶺頭單叢茶、2016年制作的蜜蘭香型嶺頭單叢茶(對照)樣品 均由廣東省饒平金利香生態農業有限公司提供;沒食子酸(>99.0%)、乙二胺四乙酸(≥99%)、兒茶素(C≥99%)標準品、表兒茶素(EC≥99%)標準品、表兒茶素沒食子酸酯(ECG≥99%)標準品、表沒食子兒茶素(EGC≥99%)標準品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG≥95%)標準品、咖啡堿(≥99%)標準品 上海融禾醫藥科技發展有限公司;抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基試劑盒 南京建成生物工程研究所;甲醇和乙腈(色譜純)、乙酸乙酯、正丁醇、抗壞血酸(>99.7%)、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸、鐵氰化鉀、鹽酸、碳酸氫鈉、濃硫酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 上海阿拉丁生物科技股份有限公司。

TU-1901型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;4-16K型臺式離心機 博動行儀器有限公司;ML204/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;ALPHA 1-4冷凍干燥機 成都華衡儀器有限公司;PHSJ-3F型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;Aglient 1200高效液相色譜儀 德國安捷倫公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將茶葉樣品粉碎,過40目篩,放置于密封袋中備用。

1.2.2 主要抗氧化成分的測定方法 茶多酚:GB/T 8313-2008[18],以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=0.0132x+0.006,R2=0.9992。黃酮:三氯化鋁比色法[19],以蘆丁的質量為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=11.161x-0.0079,R2=0.9995;游離氨基酸:GB/T8314-2013[20],以谷氨酸的濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=2.982x-0.2577,R2=0.9991,茶黃素:系統分析法[21];咖啡堿:GB/T8312-2013[22];兒茶素:參考郭穎[23]測定的方法。

1.2.3 抗氧化能力的測定

1.2.3.1 單叢茶水浸提物的制備 稱取5.00 g磨碎茶樣按照1∶10 (g/mL)加入沸蒸餾水,沸水浴浸提20 min。立即趁熱減壓過濾。同樣方法浸提四次,合并濾液,在-80 ℃ ℃經35 h冷凍干燥后得到茶水浸提物干粉[24]。

1.2.3.2 單叢茶水浸提物對DPPH自由基的清除實驗 參考曹燕妮[24]的方法,分別配制0.1 mL不同貯藏年份不同濃度的茶水浸提物稀釋液(茶水浸提物干粉與蒸餾水之比0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mg/mL),同時配制濃度分別為 0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 mg//mL的VC溶液0.1 mL,在上述溶液中加入3.9 mL 0.2 mmol/L 95%乙醇配制的DPPH自由基溶液,室溫避光反應30 min,以95%乙醇作為空白,在517 nm處測吸光度。計算清除率為50%時的單叢茶水浸提物稀釋液濃度和VC溶液濃度,記為IC50。以半數抑制濃度IC50的大小來比較抗氧化能力強弱。

式中,A0為空白樣吸光度,A1為樣品吸光度。

1.2.3.3 單叢茶水浸提物對羥基自由基的清除實驗 參考曹燕妮[24]的方法,取1 mL蒸餾水,依次加入0.75 mmo1/L鄰二氮菲1 mL,50 mmo1/L pH7.4的PBS緩沖液2 mL,充分混勻后加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4,混勻,最后加1 mL 0.01% H2O2,37 ℃保溫60 min,在536 nm處測吸光度為AP,95%乙醇代替0.01% H2O2進行上述反應測吸光度為AB,1 mL不同濃度的茶水浸提物稀釋液(茶水浸提物干粉與蒸餾水之比0.05,0.08,0.11,0.14,0.17,0.20 mg/mL)代替蒸餾水進行上述反應測吸光度為AS。計算清除率為50%時的單叢茶水浸提物稀釋液濃度和VC溶液濃度,記為IC50。以半數抑制濃度IC50的大小來比較抗氧化能力強弱。

1.2.3.4 單叢茶水浸提物還原力實驗 參考曹燕妮[24]的方法,分別在0.5 mL不同貯藏年份不同濃度茶水浸提物稀釋液(茶水浸提物干粉與蒸餾水之比0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 mg/mL)和不同濃度的的VC溶液(0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 mg/mL)中加入2.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液,再加2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液,振蕩混勻,50 ℃恒溫20 min后,再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,然后以3000 r/min離心分離10 min,取上層清液2.5 mL,加蒸餾水2.5 mL和0.10% FeC13溶液0.50 mL,在700 nm處測定吸光度。計算還原力為0.5時的單叢茶水浸提物稀釋液濃度和VC溶液濃度,記為EC50。以半數抑制濃度EC50的大小來比較抗氧化能力強弱。

1.2.3.5 單叢茶水浸提物抑制超氧陰離子自由基實驗 按照南京建成生物工程研究所試劑盒提供的方法。測定不同貯藏年份不同濃度單叢茶水浸提物稀釋液(茶水浸提物干粉與蒸餾水之比2.00,3.00,4.00,5.00,6.00 mg/mL)抑制超氧陰離子自由基作用,以抑制超氧陰離子自由基活力單位表示抗氧化能力。

1.2.3.6 綜合指數法評價抗氧化能力 引用APC綜合指數(Antioxidant potency composite index),采用以上四種抗氧化實驗結果分析不同貯藏年份嶺頭單叢茶綜合抗氧化能力[25]。

APC指數均值=方法1APC指數+方法2APC指數+…方法nAPC指數/n

1.3 統計分析

應用SPSS 19.0統計軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 貯藏時間對單叢茶幾種抗氧化成分含量的影響

2.1.1 茶多酚含量的變化 由圖1可知,單叢茶茶多酚含量隨著貯藏時間的延長而上升。貯藏20年時茶多酚含量達到最大值,由13.77 g/100 g上升到19.81 g/100 g,提高了6.04 g/100 g。各貯藏年份單叢茶的茶多酚含量均顯著高于對照(p<0.05)。貯藏5年與10年的茶多酚含量差異不顯著(p>0.05),其余各貯藏年份之間茶多酚含量差異均顯著(p<0.05)。鮑曉華[26]在普洱茶研究中發現茶多酚在7年貯藏中呈上升趨勢,多酚類物質大致可以分為水溶性的氧化產物(主要是茶黃素(TF)、茶紅素(TR)和茶褐素(TB))、未被氧化的多酚類物質(主要是殘留兒茶素)和非水溶性的轉化物,隨著貯藏時間的延長,可能是TR和TB形成較多,所以茶多酚的含量呈現上升。

圖1 不同貯藏年份單叢茶茶多酚含量的變化Fig.1 Change of the tea polyphenol in single clump tea in different storage years注:不同小寫字母表示不同貯藏年份 之間差異顯著,圖2～圖6同。

2.1.2 黃酮含量的變化 由圖2可知,單叢茶黃酮含量隨著貯藏時間的延長而上升。貯藏20年時黃酮含量達到最高,由2.19 g/100 g上升到3.05 g/1 00 g,提高了0.86 g/100 g。貯藏10、15和20年的黃酮含量顯著高于對照和貯藏5年的(p<0.05),對照與貯藏5年的黃酮含量差異不顯著(p>0.05),其余各貯藏年份之間黃酮含量差異均顯著(p<0.05)。黃酮類化合物在植物體內大部分與糖結合成苷類或以碳糖基的形式存在,也有以游離形式存在的,貯藏過程中黃酮含量的上升可能是結合形式存在的化合物轉化成游離形式而溶出[26]。

圖2 不同貯藏年份單叢茶黃酮含量的變化Fig.2 Change of the flavonoid content in single clump tea in different storage years

2.1.3 游離氨基酸含量的變化 由圖3可知,單叢茶游離氨基酸含量隨著貯藏時間的延長先下降后上升,總體呈下降趨勢。貯藏5年時達到最低。貯藏20年,由1.85 g/100 g降低到1.03 g/100 g,降低了0.82 g/100 g。各貯藏年份的游離氨基酸含量顯著低于對照(p<0.05),且各貯藏年份之間游離氨基酸含量差異均顯著(p<0.05)。游離氨基酸變化趨勢可能是由于貯藏前期游離氨基酸降解,隨著貯藏時間延長,單叢茶含水量增加,水溶性蛋白質水解速率高于降解速率,致使游離氨基酸含量呈上升趨勢[27]。

圖3 不同貯藏年份單叢茶游離氨基酸含量的變化Fig.3 Change of the free amino acids content in single clump tea in different storage years

2.1.4 茶黃素含量的變化 由圖4可知,單叢茶茶黃素含量隨著貯藏時間的延長先上升后下降。貯藏5、10和15年的茶黃素含量顯著高于對照和貯藏20年的單叢茶(p<0.05)。對照與貯藏20年、貯藏5年與10年的茶黃素含量差異均不顯著(p>0.05),其余各貯藏年份之間茶黃素含量差異均顯著(p<0.05)。茶黃素含量變化趨勢與段慧[28]在福建烏龍茶陳化機理初探一文中茶黃素變化趨勢一致,可能是由于貯藏過程中茶黃素和茶紅素是一個雙向轉化過程,一方面兒茶素氧化聚合形成茶黃素,另一方面茶黃素和兒茶素進一步氧化形成茶褐素。貯藏前期茶黃素上升,但是隨著貯藏年份的增加茶色素底物的來源兒茶素很少,貯藏中發酵程度的加深,茶黃素含量降低。

圖4 不同貯藏年份單叢茶茶黃素含量的變化Fig.4 Change of the theaflavins content in single clump tea in different storage years

2.1.5 咖啡堿含量的變化 由圖5可知,單叢茶咖啡堿含量隨著貯藏時間的延長先下降后上升再下降。貯藏5年出現最低值。貯藏20年,由4.75 g/100 g下降到3.36 g/100 g,降低了1.39 g/100 g。各貯藏年份的咖啡堿含量顯著低于對照(p<0.05)。貯藏5年與20年,貯藏10年和15年的咖啡堿含量差異均不顯著(p>0.05),其余各貯藏年份之間咖啡堿含量差異均顯著(p<0.05)。咖啡堿含量的變化趨勢這與段慧[28]在福建烏龍茶陳化機理初探研究中一致,在常溫下貯藏,咖啡堿含量減少原因可能是甲基轉移的結果[29]。咖啡堿上升的原因有待于進一步研究。

圖5 不同貯藏年份單叢茶咖啡堿含量的變化Fig.5 Change of the caffeine content in single clump tea in different storage years

2.1.6 兒茶素含量的變化 由圖6和表1可知,單叢茶5種主要兒茶素總量隨著貯藏時間的延長總體上升,貯藏20年時兒茶素總量達到最大值,由0.47 g/100 g上升到2.47 g/100 g,提高了2.00 g/100 g。各貯藏年份兒茶素總量顯著高于對照(p<0.05),且貯藏20年的兒茶素總量顯著高于其余各貯藏年份(p<0.05)。兒茶素組成中主要以ECG含量最高,其次是EGCG,在整個貯藏過程中EGCG和ECG的變化趨勢與兒茶素總量變化趨勢基本一致,貯藏20年,EGCG和ECG含量急劇上升導致兒茶素總量達到最大值,可能由于酯型兒茶素合成的前體為非酯型兒茶素和沒食子酸衍生物轉化所致,兒茶素類化合物的積累可能受到合成、水解或氧化、糖苷化、甲基化和聚合作用的共同影響[30]。

表1 不同貯藏年份單叢茶5種主要兒茶素含量g·(100 g)-1Table 1 Change of the 5 kinds main catechins content in single clump tea in different storage years(g/100 g)

圖6 不同貯藏年份單叢茶5種主要兒茶素總量的變化Fig.6 Change of the 5 kinds main catechins total content in single clump tea in different storage years

2.2 抗氧化活性實驗

2.2.1 水浸提物對DPPH自由基清除實驗結果 由表3可知,不同貯藏年份單叢茶水浸提物對DPPH自由基都表現出顯著的清除效果,且量效呈良好的線性關系(R2≥0.99),清除DPPH自由基能力均顯著低于陽性對照VC(p<0.05)。清除DPPH自由基的能力依次為VC>20年>15年>10年>5年>對照。貯藏10年與15年單叢茶清除DPPH自由基的能力差異不顯著(p>0.05),其余各貯藏年份單叢茶清除DPPH自由基的能力差異均顯著(p<0.05)。

表3 不同貯藏年份蜜蘭香單叢茶水 浸提物對DPPH自由基的清除效果Table 3 DPPH radicals scavenging ability of single clump tea water extracts in different storage years

2.2.2 水浸提物對羥基自由基清除實驗結果 由表4可知,不同貯藏年份單叢茶水浸提物對羥基自由基都表現出顯著的清除效果,且量效呈良好的線性關系(R2≥0.99)。清除羥基自由基的能力依次為20年>15年>10年>5年>對照>VC,各貯藏年份單叢茶水浸提物清除羥基自由基的能力顯著高于VC(p<0.05)。對照和貯藏5年單叢茶水浸提物清除羥基自由基的能力差異不顯著(p>0.05),其余各貯藏年份單叢茶水浸提物清除羥基自由基的能力差異均顯著(p<0.05)。

表4 不同貯藏年份單叢茶對羥基自由基的清除效果Table 4 Hydroxyl radicals scavenging ability of single clump tea water extracts in different storage years

2.2.3 水浸提物還原力測定的實驗結果 由表5可知,不同貯藏年份單叢茶水浸提物都表現出顯著的還原效果,且量效呈良好的線性關系(R2≥0.99),還原力均顯著低于陽性對照VC(p<0.05)。單叢茶水浸提物還原力依次為VC>10年>5年>20年>15年>對照,貯藏5年和10年、貯藏15年與對照、20年的單叢茶水浸提物還原力差異不顯著(p>0.05),其余各不同貯藏年份之間單叢茶水浸提物還原力均差異顯著(p<0.05)。

表5 不同貯藏年份單叢茶水浸提物還原力Table 5 Reduction power of single clump tea water extracts in different storage years

2.2.4 水浸提物抑制超氧陰離子自由基實驗結果 由圖7可知,不同貯藏年份單叢茶水浸提物抑制超氧陰離子自由基單位范圍89.6～94.6 U/g,單叢茶水浸提物的抗氧化活性依次為10年>20年>5年>15年>對照,貯藏15年與對照、貯藏5年的單從茶茶水浸提物抑制超氧陰離子自由基能力差異均不顯著(p>0.05)。其余各不同貯藏年份之間單叢茶水浸提物抑制超氧陰離子自由基能力差異均顯著(p<0.05)。

圖7 不同貯藏年份單叢茶水浸提物 抑制超氧陰離子自由基效果Fig.7 Superoxide radicals inhibiting ability of single clump tea water extracts in different storage years

2.3 綜合指數法評價抗氧化能力

不同貯藏年份的單叢茶水浸出物清除DPPH自由基和羥基自由基的能力、還原力、抑制超氧陰離子自由基能力有一定的差異,可能是由于不同自由基的檢測原理不同導致結果有一定的差異[31],故引用 APC 平均指數判斷不同貯藏年份單叢茶綜合抗氧化活性。綜合抗氧化能力的大小依次為:貯藏20年(84.78%)>10年(89.40%)>15年(90.15%)>5年(91.23%)>對照(98.67%)。

2.4 主要抗氧化成分與抗氧化活性相關性分析

由表5可知,單叢茶水浸提物清除DPPH自由基能力與茶多酚含量相關系數達到0.984,達到極顯著水平(p<0.01),與黃酮含量和兒茶素含量相關性系數分別為0.915和0.910,均達到顯著水平(p<0.05),單叢茶水浸提物清除羥基自由基能力與黃酮相關系數為0.998,達到極顯著水平(p<0.01),與茶多酚含量,兒茶素含量相關性系數分別為0.887,0.897,均達到顯著水平(p<0.05)。茶水浸提物清除DPPH自由基和羥基自由基能力與游離氨基酸、茶黃素和咖啡堿呈負相關,且不顯著(p>0.05)。茶水浸提物的還原能力與抑制超氧陰離子自由基能力與各測定成分含量相關性不顯著。由表5得出,單叢茶在貯藏過程中主要抗氧化生化成分和抗氧化活性都會發生顯著變化,兩者之間具有不同程度的相關性,且茶多酚、黃酮和兒茶素含量與清除DPPH自由基、羥基自由基的能力均達到顯著性正相關(p<0.05)。陳金娥[32]研究發現茶葉中的多酚類等物質和類黃酮化合物具有優異的抗氧化性能,它可以有效清除自由基,這與本研究的結果一致。

表5 不同貯藏年份單叢茶主要抗氧化成分 與水浸提物抗氧化活性相關性分析Table 5 The correlation analysis between the main antioxidant components and antioxidant activities of the water extract of single clump tea in different storage years

3 結論

20年貯藏期內,隨著貯藏年份的增加,蜜蘭香型嶺頭單叢茶的茶多酚、黃酮和兒茶素含量增加,游離氨基酸先下降后上升,咖啡堿含量先下降后上升再下降,茶黃素含量基本穩定不變。不同貯藏年份的嶺頭單叢茶清除DPPH自由基和羥基自由基的能力,抑制超氧陰離子自由基的能力及還原力均有差異,通過綜合指數法(APC)評價不同貯藏年份單叢茶抗氧化活性大小依次為:貯藏20年>10年>15年>5年>對照。蜜蘭香型嶺頭單叢茶水提物對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力與茶多酚、黃酮、兒茶素的含量呈顯著性正相關(p<0.05),還原能力和抑制超氧陰離子自由基能力與抗氧成分之間相關性不顯著。