十種添加物對紅曲菌monacolin K產量的 促進效果分析

柴詩緣,張安安,梁 健,張晨曦,王成濤,張 嬋，*

(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048;3.中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193)

紅曲菌是我國重要的藥食兩用微生物資源之一,其發酵產品紅曲在我國及東南亞地區有上千年的應用歷史,主要用于食品色素、醫藥、釀酒等方面[1]。紅曲菌能夠產生多種次級代謝產物,包括monacolin K[2]、紅曲色素[3-4]、γ-氨基丁酸[5-8]、麥角固醇[9]、桔霉素[10]等。研究發現,紅曲菌中monacolin K具有抑制膽固醇合成中關鍵酶HMG-CoA活性的作用[11],所以能夠有效的抑制膽固醇合成,顯著降低其含量,紅曲中monacolin K是1979年日本學者遠藤章首次分離得到的[12]。近年來,隨著人們對紅曲藥用、生理價值的深入研究,已經開發出對高血壓、高血脂等具有顯著療效的功能性紅曲產品,如血脂康、脂必妥等。現代研究表明,作為膽固醇合成抑制劑的monacolin K具有高效、低毒、安全等特點[13],是目前醫藥界公認的降低膽固醇的理想藥物之一,因此引起科研工作者的深入研究。

紅曲菌中monacolin K活性成分含量偏低、生產成本高等因素,嚴重制約了功能性紅曲在降脂降壓方面作用的發揮,以及功能紅曲產品的大規模產業化發展。近年來,為了提高功能紅曲的品質,研究人員在優化發酵條件等方面進行了大量深入而細致的研究工作,如Rashmi Dikshit[14]和Lijuan Yu[15]等人通過響應面法對培養基發酵條件進行優化來提高monacolin K產量;陳小林[16]、馬義芝[17]和趙樹欣[18]等人通過在培養基中添加不同的誘導物來促進monacolin K的合成。由于實驗菌株、處理方法及檢測方法不同,不能很好的確定哪種添加物是最佳誘導物。因此,本文比較了目前已見報道的對于提高紅曲菌monacolin K產量的10種添加物,采用同一菌株,同樣的發酵條件、處理方法及檢測方法,探尋針對紫色紅曲菌的一種最佳添加物,同時也對這10種添加物對紅曲色素和桔霉素的影響進行檢測,為實現功能紅曲高產提供理論依據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲菌菌株(MonascusPurpureus)M1 本實驗室保存;葡萄糖、瓊脂、甲醇,色譜純 北京奧博星生物技術責任有限公司;甘油、PDA、YPD 北京半夏科技有限公司;monacolin K(純度≥98%)、桔霉素(純度≥98%) Sigma公司。

LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;M-pact AX124型分析天平 上海歡奧科技公司;HZQ-F160型全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠;PHS-3D功能型pH計 上海三信儀表廠;20A型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外可見光分光光度計 日本島津公司;超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;SU8010型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 培養基

馬鈴薯固體培養培養基[19](PDA)(g/L):葡萄糖20,蛋白胨3,酵母浸粉4,麥芽浸粉20,瓊脂20,KH2PO42,NaNO32,MgSO4.7H2O 1。普通液體種子培養基[19](g/L):葡萄糖30,豆粕粉15,蛋白胨10,甘油70,KH2PO42,NaNO32,MgSO4.7H2O 1。普通液體發酵培養基[19](g/L)(空白對照組):甘油90,大米粉20,蛋白胨10,KH2PO42.5,NaNO35,MgSO4.7H2O 1,ZnSO4.7H2O 2。山藥粉-發酵培養基[17](g/L):在普通液體發酵培養基中按3%(V/V)加入山藥粉。桔皮粉-發酵培養基[16](g/L):在普通液體發酵培養基中按2%(V/V)加入桔皮粉。酵母菌液-發酵培養基[18](g/L):YPD培養基30 ℃平板培養1 d酵母細胞,用接種環刮取1環菌體接種到YPD液體培養基中,30 ℃、200 r/min培養1 d,制備酵母菌液。向普通液體發酵培養基中按10%(V/V)的接種量接入酵母菌液。酵母上清液-發酵培養基[18](g/L):發酵1 d后的酵母菌液經12000 r/min離心15 min后取上清,按2.67%(V/V)的接種量接入普通發酵培養基中。酵母破壁液-發酵培養基[18](g/L):發酵1 d后的酵母菌液經12000 r/min離心15 min,無菌水洗滌后在滅菌的研缽中研磨10 min后12000 r/min離心15 min,取上清即為酵母破壁液。向普通液體發酵培養基中按2.67%(V/V)的接種量接入酵母破壁菌液。破壁后的酵母菌液-發酵培養基(g/L):發酵1 d后的酵母菌液經12000 r/min離心15 min,無菌水洗滌后研磨10 min后12000 r/min離心15 min,取沉淀,按2.67%(V/V)的接種量接入普通發酵培養基中。亮氨酸-發酵培養基[17](g/L):在普通液體發酵培養基中按10 mmol/L加入亮氨酸。谷氨酸-發酵培養基[17](g/L):在普通液體發酵培養基中按10 mmol/L加入谷氨酸。乙醇-發酵培養基[1](g/L):在普通液體發酵培養基中按2.5%(V/V)加入乙醇。優化培養基-發酵培養基[1](g/L):甘油90,葡萄糖50,蛋白胨10,KH2PO42.5,NaNO35,MgSO4·7H2O 1,ZnSO4.7H2O 2。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養 菌株活化:將M1菌株在馬鈴薯固體培養基上30 ℃培養3 d,活化2代。

種子液的制備:用接種環刮取1環菌液到普通液體種子培養基中,30 ℃、200 r/min培養2 d。

發酵液的制備:按10%的接種量將種子液接種到普通液體發酵培養基中,25 ℃、150 r/min培養12 d。

1.3.2 不同添加物對紅曲菌發酵產monacolin K、桔霉素和發酵液色價的影響 將M1菌株在種子液中培養2 d后,將種子液按10%的接種量分別接到普通液體發酵培養基、山藥粉-發酵培養基、桔皮粉-發酵培養基、酵母菌液-發酵培養基、酵母上清液-發酵培養基、酵母破壁液-發酵培養基、破壁后的酵母菌液-發酵培養基、亮氨酸-發酵培養基、谷氨酸-發酵培養基、乙醇-發酵培養基和優化培養基-發酵培養基中。25 ℃、150 r/min培養12 d后,檢測各培養基中monacolin K、桔霉素及色價產量。其中普通液體發酵培養基為空白對照組,其余的為實驗組,進而確定最佳添加物。

1.3.3 谷氨酸添加量的研究 根據“2.1”的實驗結果確定最佳添加物為谷氨酸,為探究谷氨酸的適宜添加量。本實驗在10 mmol/L添加量附近選取8、9、11、12 mmol/L谷氨酸進行添加,將發酵液25 ℃、150 r/min培養12 d后對其monacolin K產量進行檢測。

1.3.4 monacolin K的檢測

1.3.4.1 發酵液的預處理 各取空白對照組和實驗組發酵液5 mL,加入15 mL 75%的甲醇,超聲波萃取30 min,靜置過夜,取上清液經0.45μm的有機濾膜過濾,檢測濾液中monacolin K含量。

1.3.4.2 monacolin K的檢測 參考王蘭[20]檢測方法。將monacolin K標品分別稀釋成5、20、50、80、100、150、200 mg/L標準溶液,然后經HPLC檢測繪制標準曲線,根據標準曲線得到回歸曲線方程:y=37558x+181164,R2=0.9986,其中橫坐標(x)為濃度,縱坐標(y)為峰面積,R為相關系數。HPLC檢測條件:色譜柱:InertsilODS-3 C18(150 mm×4.6 mm×5 μm),流動相:0.1%磷酸∶甲醇=1∶3,流速1 mL/min,檢測器為紫外檢測器,檢測波長237 nm,檢測溫度30 ℃,進樣量10 μL。

monacolin K產量計算公式:

1.3.5 桔霉素的檢測

從J社區的拆遷案例可以看出，地方政府在回應有權勢的釘子戶抗爭時，為了維持基層社會的穩定有序，總是在有限的范圍內盡可能以“妥協讓步”的方式尋求與釘子戶的一致約定，這和以往的“硬策略”形成鮮明對比。因此，為了“避免出事”，地方政府在應對釘子戶抗爭上付出的成本和代價是高昂的。

1.3.5.1 發酵液的預處理 取發酵液5 mL,加入10 mL無水乙醇,超聲破碎細胞15 min,60 ℃水浴振蕩1 h,冷卻至室溫,取上清液經0.45μm的有機微孔濾膜過濾,檢測濾液中桔霉素含量。

1.3.5.2 桔霉素的檢測 參考黃艷[21]等檢測方法。將桔霉素標品分別稀釋成0.05、0.2、2、4、8、12、16 mg/L標準溶液,然后經HPLC檢測繪制標準曲線。根據標準曲線得到回歸曲線方程:y=6×106x+13203,R2=1,其中橫坐標(x)為濃度,縱坐標(y)為峰面積,R為相關系數。HPLC檢測檢測條件:色譜柱:YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm×5 μm),流動相:乙腈∶水(磷酸調pH2.5)=35∶65,流速:1.2 mL/min,檢測器:熒光檢測器,激發波長λex=331 nm,發射波長λem=500 nm,柱溫28 ℃,進樣量20 μL。

桔霉素產量計算公式:

1.3.6 色價的測定 取發酵液5 mL,加入15 mL 70%的乙醇溶液,于恒溫水浴鍋60 ℃浸提1 h,靜置。用分光光度計測定410、505 nm處吸光值。根據以下公式計算色價。

紅曲紅色素色價(U/mL)=OD505×稀釋倍數

紅曲黃色素色價(U/mL)=OD410×稀釋倍數

1.3.7 生物量的測定 菌絲體生物量采用干重法測定:各取5 mL空白對照組和實驗組的發酵液,用3層紗布過濾,再用蒸餾水洗滌2～3次,擰干水分,在60 ℃烘箱中烘干至恒重,即為菌絲體干重[22]。

生物量(g/L)=干物質質量/發酵液體積

1.3.8 掃描電鏡處理 培養8 d 的紅曲菌菌體,12000 r/min離心5 min收集菌體細胞,將細胞重懸于2.5%戊二醛溶液(PBS緩沖溶液稀釋,pH7.2)固定12 h。掃描電鏡樣品處理方法具體參考Zhang[23]等,最后至樣品成粉末狀即可,Eiko IB-3 型離子濺射儀噴金,留待觀察。

1.4 數據處理

實驗操作重復三次,采用Excel進行數據計算,SPSS Statistics軟件進行多重比較分析,Origin8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同培養基中monacolin K產量的檢測

由圖1可知,當在普通培養基中添加山藥粉和谷氨酸時,monacolin K產量與空白對照組相比差異極顯著(p<0.01),產量分別提高了2.49和5.60倍,達到了107.7和203.8 mg/L;添加亮氨酸時,monacolin K產量與空白對照組相比差異顯著(p<0.05),產量提高了1.12倍,達到了65.4 mg/L;添加酵母上清液和破壁后的酵母菌液時monacolin K產量也略有提高,但并不顯著;添加酵母破壁菌液和乙醇導致monacolin K的產量降低;而添加桔皮粉則使monacolin K的產量降低至0。推測由于添加桔皮粉導致發酵液粘稠,溶氧降低后抑制紅曲菌的生長,而紅曲菌是好氧真菌,所以桔皮粉的添加對紅曲菌的生長和monacolin K的合成有著抑制的作用。陳小林等[16]、馬義芝等[17]、朱振元等[24]、趙樹欣等[18]、吳學倩等[1]分別發現山藥粉、谷氨酸、酵母破壁液、酵母、酵母上清液液、酵母細胞破碎液、葡萄糖代替大米粉都可以提高monacolin K的產量。但在本實驗中,只有山藥粉、谷氨酸和山藥粉顯著提高了monacolin K產量,其余物質對monacolin K產量的提高并不顯著。

圖1 不同培養基對monacolin K產量的影響Fig.1 Effects of different medium components on monacolin K production in Monascus注:與普通組相比,*代表差異顯著(p<0.05)，**代表差異極顯著(p<0.01);圖2、圖3同。

2.2 桔霉素檢測結果

結果如圖2所示,其中添加酵母上清液、谷氨酸和桔皮粉的培養基桔霉素產量稍有變化,但并不顯著;其余幾種培養基桔霉素產量均極顯著(p<0.01)的低于空白對照組;其中添加山藥粉和乙醇的培養基桔霉素產量為0。馬義芝[17]等人發現精氨酸和亮氨酸可以促進紅曲霉桔霉素生成,而賴氨酸,甘氨酸,谷氨酸和酪氨酸抑制桔霉素的生成。結合2.1的實驗結果綜合考慮,添加谷氨酸即可以促進monacolin K的合成又不會顯著的提高桔霉素的產量,所以選取谷氨酸為最佳添加物。

圖2 不同培養基對桔霉素產量的影響Fig.2 Effects of different medium components on citrinin concentration in Monascus

2.3 色價檢測

由圖3可知,空白對照組紅曲紅色素為47.36 U/mL,紅曲黃色素為35.2 U/mL。與空白對照組相比添加酵母菌液能極顯著(p<0.01)的提高紅曲紅色素產量,提高了37.8%,產量為65.28 U/mL;添加山藥粉和酵母上清液時能顯著(p<0.05)的提高紅曲紅色素產量。當添加山藥粉、酵母菌液、酵母上清液和破壁后的酵母菌液時,能極顯著(p<0.01)的提高紅曲黃色素的產量,其中添加酵母菌液后紅曲黃色素產量為最高,提高了51.4%,產量為50.88 U/mL。趙樹欣[20]等人也發現酵母菌液、酵母上清液和破壁后的酵母菌液可以提高紅曲色素的產量。推測是因為紅曲菌為抵御殼聚糖酶的作用,紅曲菌自身產生疏水性物質如紅曲色素。而添加桔皮粉、亮氨酸、谷氨酸、乙醇會對紅曲色素產量產生抑制作用。據報道色素合成是一個需氧過程,而添加桔皮粉后培養基粘稠度增大,會使溶氧量降低。因此推測添加桔皮粉后會降低培養基溶氧量,從而降低色素產量。張斌[25]等人通過對比20種氨基酸對紅曲色素的影響發現,亮氨酸和谷氨酸會降低紅曲色素的產量,與本研究的結果具有一致性。

圖3 不同培養基對紅曲色素色價的影響Fig.3 Effects of different medium components on pigments value in Monascus

2.4 不同濃度谷氨酸培養基中monacolin K產量

通過檢測十種培養基的發酵液,發現10 mmol/L谷氨酸的添加量可以顯著提高monacolin K的產量,因此本研究通過優化谷氨酸的添加量進一步探究谷氨酸對紅曲菌的最佳添加量。由圖4可知,當谷氨酸的添加量為10 mmol/L時,monacolin K的產量最高,為217 mg/L,所以選取10 mmol/L為最佳添加量并進行后續實驗。

圖4 不同濃度谷氨酸添加量的培養基中monacolin K產量Fig.4 The monacolin K production in the medium of different glutamate content

2.5 生物量的測定

通過對monacolin K產量的測定發現谷氨酸可以極顯著(p<0.01)提高monacolin K 產量,所以對谷氨酸培養基中的菌體和普通培養基中的菌體進行生物量測定,對比其菌體生長情況。由圖5可知,添加谷氨酸的培養基中菌體重量高于普通培養基中菌體重量,說明谷氨酸可能會促進菌體生長,進而提高monacolin K產量。

圖5 谷氨酸與原始培養基中菌體干重變化情況Fig.5 The biomass in the glutamic acid medium and the original medium

2.6 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡對谷氨酸培養基中的紅曲菌菌絲體形態進行了觀察,掃描電鏡結果顯示,與對照組相比,谷氨酸培養基中的紅曲菌菌體表面出現皺縮、膨大、彎曲或斷裂現象;對照組中菌絲更加飽滿,菌絲體分枝頂端有單個或多個成鏈狀的分生孢子,孢子呈球形或橢球形。通過圖6中C、F對比可以看出添加了谷氨酸后的菌體皺縮現象更為突出,推測其細胞膜通透性增強[21],進而使胞內的monacolin K轉移到胞外,從而使發酵液中monacolin K產量提高。

圖6 不同培養基中不同放大倍數的紅曲菌 M1 形態。Fig.6 M1 form of different magnification in different culture medium

3 結論

本研究發現添加山藥粉、酵母上清液、破壁后的酵母菌液、亮氨酸與谷氨酸均能提高monacolin K產量,其中加入谷氨酸效果極顯著(p<0.01),提升倍數為5.60倍;山藥粉其次,提升倍數為2.50倍。結合桔霉素和色價的測定結果,發現添加山藥粉后桔霉素產量大幅降低,紅色素和黃色素產量增加,但monacolin K產量較低;而添加谷氨酸雖然對桔霉素產量影響不顯著,且紅色素和黃色素產量降低,但可以顯著促進monacolin K合成,所以選取谷氨酸為最佳促進monacolin K合成的添加物。本研究又進一步探尋了谷氨酸的最佳添加量,發現谷氨酸添加量為10 mmol/L時monacolin K產量最高,為217 mg/L。通過掃描電鏡觀測菌絲體形態變化發現,谷氨酸會使紅曲菌菌體表面皺縮、膨大、彎曲或斷裂現象增多。