泡菜中對(duì)鉛有高吸附性的 乳酸菌的分離鑒定及特性研究

代啟虎,歐 杰,李 冉,李柏林

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,上海 201306)

環(huán)境中重金屬的污染越來越嚴(yán)重,有害重金屬一旦進(jìn)入人體,在體內(nèi)會(huì)形成蓄積物,難以被降解或排出,從而在機(jī)體器官富集,造成不可逆的損傷,對(duì)人體產(chǎn)生極大傷害。如日本水俁病、痛痛病以及我國的“鎘米”、“血鉛”等公共污染事件。鉛是一種對(duì)人體有害的重金屬,進(jìn)入生物體后,Pb2+積累在腎臟和肝臟,引起腎、肝的損傷,破壞基本的細(xì)胞過程并且會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)[1-2]。

生物修復(fù)因其原料廣泛、成本低、操作簡單、環(huán)保,低濃度有較好的去除效果,在低濃度污染治理上也有較好的應(yīng)用空間,而且不會(huì)產(chǎn)生次生危害等特點(diǎn),成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)[3-4],目前主要用螯合物治療重金屬中毒,但治療的同時(shí)會(huì)有不良影響,對(duì)機(jī)體造成損傷、解毒不完全等弊端[5-6]。

乳酸菌是公認(rèn)的安全級(jí)微生物,能夠耐受胃酸、膽汁和酶的能力。口服制劑可順利到達(dá)腸道,能夠改善機(jī)體機(jī)能,它對(duì)腸道調(diào)控、保護(hù)、修復(fù)的作用已經(jīng)被證實(shí)[7]。隨著研究的不斷深入,有研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌對(duì)重金屬有著良好的抗性和吸附性能,并且乳酸菌作為人體腸道內(nèi)的有益菌群,對(duì)人體健康也有很好的保健作用[8]。于上富等[9]研究發(fā)現(xiàn)在鉛離子初始濃度為9.6 mg/L,加菌量4.2 g/L時(shí)德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)KLDS1.0207 鉛離子去除率高達(dá)95.17%。Halttunen[10]研究發(fā)現(xiàn)LactobacillusrhamnosusGG對(duì)鎘、鉛去除率分別為20.1%和60.1%,L.rhamnosusLC705對(duì)鎘、鉛去除率分別為30%和45%,BifidobacteriumbreveBbi99/E8對(duì)鎘、鉛去除率分別為40%和50%。

國內(nèi)外將乳酸菌作為生物吸附劑的研究還是比較少的,大多數(shù)的乳酸菌吸附效率較低,并且大多數(shù)對(duì)重金屬有吸附性的乳酸菌用于食品或人體中還有待考量,而本實(shí)驗(yàn)從泡菜中分離具有鉛抗性和高吸附性的乳酸菌,可以直接用于腌制泡菜、污水中重金屬的去除,并為動(dòng)物體內(nèi)鉛的去除奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基sigma aldrich公司;泡菜 成都古味覺食品有限公司;乙酸鉛(AR)、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色鏈珠菌(CanidiaAlbicans)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus) 上海魯微科技有限公司。

ZHJH-C1112C 超凈工作臺(tái)上海智城分析儀器制造有限公司;AUY120 電子分析天平日本島津公司;LRH-150F 生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;YXQ-LX高壓蒸汽滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;PB-10 pH計(jì)德國賽多利斯股份公司;VITEK MS質(zhì)譜儀法國生物梅里埃公司;ZWY-2102C搖床上海智城分析儀器制造有限公司;AA-7000火焰原子分光光度計(jì)日本島津公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐鉛菌株的分離及穩(wěn)定性測定 稱取20.0 g泡菜于45 mL無菌生理鹽水中,37 ℃、150 r/min振蕩30 min后倍比稀釋到10-4,各取0.1 mL分別涂布于含有400 mg/L Pb2+的MRS固體平板上,37 ℃ 培養(yǎng)36 h時(shí)。根據(jù)菌落形態(tài),挑取疑似乳酸菌菌落逐步在含有800、1200、1600、2000 mg/L Pb2+的MRS固體培養(yǎng)基上接種,37 ℃培養(yǎng)36 h時(shí),在含2000 mg/L Pb2+條件下得到的菌株為目的菌株,并依次命名為p1、p2、p3…。將分離得到的單菌落菌株,接種到MRS斜面培養(yǎng)基中,在37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h后放置4 ℃的冰箱保藏[11]。

將獲得的菌株在含Pb2+400 mg/L的MRS瓊脂培養(yǎng)基傳5～8代,根據(jù)菌株在培養(yǎng)基上的生長狀況判斷其穩(wěn)定性。

1.2.2 耐性菌株的吸附鉛實(shí)驗(yàn) 菌株接種于液體MRS培基中,37 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng)2 d,離心收集菌體,用滅菌的去離子水洗滌2遍。稱取一定重量菌體(干重)加入到30 mL分別含30 mg/L和100 mg/L Pb2+的溶液中,使菌體濃度達(dá)到3 g/L,37 ℃,150 r/min搖床吸附48 h后,12000 r/min離心5 min,取上清用火焰原子分光光度計(jì)測吸光度并計(jì)算Pb2+的濃度[12]。菌株對(duì)鉛的吸附能力按下式計(jì)算:

式中:C0為最初鉛離子濃度,C為加菌處理后鉛離子濃度。

1.2.3 菌株的初步鑒定 將目的菌株接種于MRS平板上,37 ℃培養(yǎng)36 h,觀察菌落形態(tài)、進(jìn)行革蘭氏染色,并選取主要的8種生化試劑對(duì)目的菌進(jìn)行常規(guī)生化鑒定[13]。

1.2.4 菌株的質(zhì)譜鑒定 挑取適量菌株于質(zhì)譜儀樣品檢測板上,加0.5 μL 70%甲酸覆蓋菌株,隨后加1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)溶液覆蓋。放置于室溫,干燥后,將檢測板放入質(zhì)譜儀檢測。

儀器參數(shù):LTB MNL 100 nitrogen laser激光器;激光頻率60 Hz,線性正離子(LP)采集模式;加速電壓2.10 kV,激發(fā)電壓20.00 kV,聚焦電壓6.00 kV,檢測電壓2.63 kV,質(zhì)量范圍2000～20000 Da。每次實(shí)驗(yàn)前用ATCC8739進(jìn)行質(zhì)譜儀的質(zhì)量校正。將靶板送入MALDI-TOF-MS/MS 進(jìn)樣倉,用Launchpad 2.9軟件進(jìn)行質(zhì)譜采集,并用SARAMIS 4.12分析軟件進(jìn)行比對(duì)鑒定分析、聚類分析和主成分分析以及離子峰分析。

1.2.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定 DNA的提取:用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株總DNA作為模板,選擇通用引物 27F:5′-AGTTTGA TCMTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′作為擴(kuò)增引物,PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,用DNA回收試劑盒回收目的條帶,送上海生工生物科技公司測序,結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 菌株生長特性研究

1.2.6.1 生長曲線的測定 接3%活化后的菌株于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng),不同時(shí)間取出,以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照,測定OD600值,繪制菌株的生長曲線。

1.2.6.2 溫度對(duì)菌株生長的影響 接3%活化后的菌株于MRS液體培養(yǎng)基中,置于28、30、35、37、40 ℃的恒溫?fù)u床中150 r/min培養(yǎng),以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照,培養(yǎng)24 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制生長曲線。

1.2.6.2 鹽對(duì)菌株生長的影響 將活化好的菌株分別接種于含0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中,以不接菌的做空白對(duì)照,37 ℃、150r/min下?lián)u床培養(yǎng),36 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制曲線。

1.2.6.3 番茄汁對(duì)菌株生長的影響 將活化好的菌株分別接種于含0、2%、4%、6%、8%、10%(v∶v)的番茄汁的MRS液體培養(yǎng)基中,以不接菌的做空白對(duì)照,37 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng),36 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制曲線。

1.2.6.4 酸耐受實(shí)驗(yàn) 用HCl和NaOH將MRS液體培養(yǎng)基pH分別調(diào)至為1、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10,滅菌后測初始接菌pH,將活化好的菌株分別接種于上述pH的MRS液體培養(yǎng)基中,以不接菌作為空白,37 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng),36 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制曲線。

1.2.6.5 膽鹽耐受實(shí)驗(yàn) 將活化的菌株分別接種于含2.0、4.0、6.0、8.0 g/L膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,以不加膽鹽的為空白對(duì)照,37 ℃培養(yǎng)36 h,稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后,涂布在MRS固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24 h,觀察菌株的生長狀況并計(jì)數(shù)。

1.2.6.6 消化酶耐受實(shí)驗(yàn) 將活化的菌株分別接種于含0.4、0.8、1.1 g/L胰蛋白酶的MRS液體培養(yǎng)基中,以MRS培養(yǎng)基為對(duì)照,37 ℃培養(yǎng)36 h,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,涂布在MRS固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24 h,觀察菌株的生長狀況,并計(jì)數(shù)。

1.2.6.7 抑菌實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[14]用銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus、白色鏈珠菌(CanidiaAlbicans)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus),以無菌水作空白對(duì)照,測定菌株的抑菌性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,用SPSS 23軟件進(jìn)行顯著性分析,并用origin 85軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鉛菌株的分離及穩(wěn)定性測定

通過菌株的篩選與分離,最終得到4株耐鉛菌株p1～p4,耐鉛濃度高達(dá)2000 mg/L。傳代多次,生長狀況無顯著變化,說明對(duì)鉛的耐性穩(wěn)定。

2.2 菌株吸附鉛實(shí)驗(yàn)

由圖1可知,在不同初始濃度(30和100 mg/L)的鉛溶液中,不同菌株對(duì)鉛吸附能力上差別很大,其中p3菌株在不同初始鉛濃度條件下,對(duì)鉛的吸附能力都是最強(qiáng)的,在100 mg/L的鉛溶液中,對(duì)鉛的吸附率達(dá)到78.90%±0.40%,具有研究價(jià)值。

圖1 菌株對(duì)鉛的吸附能力Fig.1 The adsorption ability of strains to lead 注:標(biāo)有不同字母表示菌株間具有顯著性差異,p<0.05。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株的初步鑒定 p3菌株的菌落形態(tài)為乳白色圓形,菌落小,表面光滑。經(jīng)革蘭式染色觀察,細(xì)胞成對(duì)或成鏈排列的革蘭式陽性菌,主要的生化鑒定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明p3菌株為乳桿菌屬。

表2 p3菌株的生化特性Table 2 Biochemical characteristics of p3 strain

2.3.2 菌株的質(zhì)譜鑒定 p3菌株的質(zhì)譜圖譜如圖4所示,用儀器配套軟件SARAMIS 4.12 將獲得的質(zhì)量圖譜與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜庫進(jìn)行比對(duì)鑒定,與短乳桿菌相似度為96%,鑒定結(jié)果表明p3為短乳桿菌。

圖2 p3菌株的質(zhì)譜圖譜Fig.2 Mass spectrum picture of p3 strain

2.3.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 將得到的菌株16S rDNA基因序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì),選取相似度較高的模式菌株作為對(duì)比,

用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行聚類性分析,得到的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知p3菌株與LactobacillusbrevisATCC 14869(T)親緣關(guān)系最接近,相似度在99.7% 以上,因此認(rèn)定p3菌株為短乳桿菌。

圖3 菌株p3的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenic tree of strain L4 based on 16S rDNA sequence

2.4 p3菌株生長特性研究

2.4.1 生長曲線測定結(jié)果 由圖4可知,該菌株在0～2 h處于延滯期,2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,14 h進(jìn)入穩(wěn)定期,菌體含量基本達(dá)到最大。

圖4 菌株生長曲線Fig.4 The strain’s growth curve

2.4.2 溫度對(duì)菌株生長的影響 溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一,當(dāng)溫度改變時(shí),微生物生長繁殖也會(huì)受到影響。微生物的最適生長溫度可能是由溫度對(duì)生物體內(nèi)無數(shù)個(gè)酶反應(yīng)的綜合作用決定的。由圖5可知,隨著溫度的升高,菌體含量增大,且在35 ℃時(shí),菌體含量達(dá)到最大,由此認(rèn)為菌株的最適溫度為35 ℃,在隨著溫度升高,菌體含量降低。

圖5 溫度-OD值曲線Fig.5 Temperature-OD valuecurve

2.4.3 番茄汁濃度對(duì)菌株生長的影響 由圖6可知,隨著番茄汁濃度升高,菌體含量先增大后下降,當(dāng)番茄汁濃度為2%時(shí)菌體含量最大。這是由于番茄汁中含有菌株的生長因子,促進(jìn)了菌株的生長繁殖,由于每個(gè)試管液體總體積、初始MRS液體培養(yǎng)基的濃度一定,及隨著番茄汁濃度的升高,降低了MRS液體培養(yǎng)基的濃度,從而減少了菌體濃度。

圖6 番茄汁含量-OD值曲線Fig.6 Tomato juice concentration-OD value curve

2.4.4 酸耐受實(shí)驗(yàn) 由圖7可知,菌株在不同的初始pH環(huán)境中培養(yǎng)36h后,菌體含量差異很大,該菌株在pH4～8范圍時(shí),生長較好。隨著pH的升高,菌濃度逐漸增大,在pH為6.5時(shí),達(dá)到最大,之后隨pH升高而降低,因此可以認(rèn)為菌株的最適pH為6.5。pH對(duì)乳酸菌的生長影響很大,這是因?yàn)榧?xì)胞膜通透性受其影響,從而影響菌株對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

圖7 pH-OD值曲線Fig.7 pH-OD value curve

2.4.5 鹽耐受實(shí)驗(yàn) 由圖8可知:菌株在含不同的鹽濃度MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后,菌體含量差異較大,當(dāng)含鹽量為0% 時(shí),菌體含量最大,且隨鹽濃度升高,菌體含量下降。鹽濃度在0%～5%時(shí),菌株生長較好。這是由于隨鹽濃度升高,引起滲透壓增大,使細(xì)胞內(nèi)水分外流,細(xì)胞胞質(zhì)分離,對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理上造成損傷,導(dǎo)致細(xì)胞停止生長,當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí),甚至造成死亡。由于該菌株是從泡菜中分離得到的,所以比大多數(shù)從其它樣品中分離得到的乳酸菌具有更高的鹽耐受性,李洪淼等[15]從泡菜中分離出的4株乳酸菌在鹽度為6%時(shí)基本不生長。

圖8 鹽濃度-OD值曲線Fig.8 Salt concentration-OD value curve

2.4.6 膽鹽耐受實(shí)驗(yàn) 由圖9可知,隨著膽鹽濃度升高,活菌數(shù)逐漸減少,在膽鹽濃度達(dá)8 g/L時(shí)仍生長良好,及菌株能在一定濃度的膽鹽條件下生長,人體小腸膽鹽濃度一般在3 g/L以下,及該菌株可以很好的存在于小腸內(nèi)。該結(jié)果比劉宏宇等[16]測得10株乳酸菌具有更高的耐膽鹽性,這10株菌的耐膽鹽性僅有5 g/L。

圖9 不同膽鹽濃度下活菌數(shù)變化Fig.9 The change of live bacteria number under different bile salt concentration

2.4.7 消化酶耐受實(shí)驗(yàn) 由圖10可知與對(duì)照組相比,結(jié)果表明,該菌株在含1.1 g/L胰蛋白酶的MRS培養(yǎng)基中生長良好,及菌株能在一定濃度的胰蛋白酶條件下生長。并且該菌株耐胰蛋白酶性比夏爽等[17]分離的20株耐胰蛋白酶的菌株具有更高的耐胰蛋白酶性,這20株菌的耐耐胰蛋白酶性僅有1 g/L。

圖10 不同胰蛋白濃度下活菌數(shù)變化Fig.10 The change of viable count under different trypsin concentration

2.4.8 抑菌實(shí)驗(yàn) 由表3可知,菌株對(duì)枯草芽孢桿菌、菌株對(duì)銅綠假單胞菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌均有一定的抑制性,其中對(duì)銅綠假單胞菌的抑制效果最好。

表3 菌株抑菌性Table 3 Antimicrobial activity

3 結(jié)論與討論

利用微生物去除重金屬已經(jīng)成為研究熱點(diǎn),與傳統(tǒng)方法相比,微生物去除重金屬具有成本低廉、來源廣、吸附速度快、吸附量大等特點(diǎn)。已經(jīng)有從動(dòng)物腸道、土壤、食品等材料中分離乳酸菌的報(bào)道,但是從泡菜中分離篩選乳酸菌清除重金屬的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)從泡菜中篩選出一株對(duì)鉛具有高耐受性和吸附性的p3菌株,對(duì)鉛的耐受性達(dá)2000 mg/L,對(duì)鉛的吸附率高達(dá)78.90%。通過形態(tài)、生理生化特征,質(zhì)譜鑒定及16S rDNA序列測定,鑒定結(jié)果p3菌株為短乳桿菌。該菌株在含鹽0～5% 時(shí)生長良好,能耐受pH為2的酸、8 g/L膽鹽和1.1 g/L的胰蛋白酶,在pH初值為6.5,溫度為35 ℃,番茄汁濃度為2%時(shí)菌體濃度最大。

短乳桿菌分布廣泛,在泡菜中特別常見,在消化系統(tǒng)中小腸含量最多。研究和報(bào)道表明,短乳桿菌具有高產(chǎn)酸、解毒、抑菌和提高機(jī)體免疫力等多種生理功效[18-21]近年來已逐漸被廣泛的應(yīng)用在食品生產(chǎn)、飼料加工、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及畜禽疾病防治等方面[22-26]。而對(duì)鉛有高耐受性和高吸附性的短乳桿菌尚未見到報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)篩出的短乳桿菌對(duì)不僅對(duì)鉛具有高耐受性和高吸附性,對(duì)酸、鹽、膽鹽以及胰蛋白酶都有一定耐受性,并且對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及蠟狀芽孢桿菌都有抑制作用。