一株高產堿性磷酸酶菌株的 分離鑒定及其培養基配方優化

高俊乾,黃俊元,張君奇,蔡佳佳,亓正良,劉 浩

(天津科技大學生物工程學院,天津 300457)

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,EC 3.1.3.1,簡稱AKP)是一類普遍存在于生物體內的非特異磷酸單酯酶[1],可以催化幾乎所有磷酸單酯的水解反應,因其在堿性環境下最為有效,故得名堿性磷酸酶。堿性磷酸酶是一組同工酶,多為同源二聚體蛋白。堿性磷酸酶在生物體內可直接參與鈣、磷的消化吸收分泌及骨化過程等[2],還可以用于免疫學酶聯免疫吸附測定[3]和免疫印跡分析[4-5]、生物傳感器識別元件的構建[6](如有機磷農藥降解[7]、水體富營養化檢測[8-9]、環境監測[10]、含磷有機物質的礦化過程[11]等)、非同位素探針[12]和斑點雜交[13]等方面。因此堿性磷酸酶具有較高的應用價值。

Remy Albrecht等[10]在綠色廢物和污水污泥共堆肥中測定的堿性磷酸酶活力最高為1117 U;Adrianne NEdwards等[14]在Clostridium difficile中過表達phoZ基因,堿性磷酸酶酶活最高為4830 U;莊百川[15]在芽孢桿菌中測定得到堿性磷酸酶活性最高為2250 U。目前商品化的堿性磷酸酶主要來源于動物體或植物體,但其產率低、價格昂貴、活性差,使它的使用受到限制[15],因此篩選具有產量高、活性高的堿性磷酸酶微生物菌種顯得尤為重要。

本文從土壤中篩選到一株高產堿性磷酸酶菌株,對影響其產堿性磷酸酶的主要因素碳源、氮源、無機鹽及初始pH進行研究,在此基礎上利用響應面設計優化產酶,從而為堿性磷酸酶生產提供了新的微生物資源,同時對該菌產堿性磷酸酶的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 天津大港海水養殖場附近;KOD plus聚合酶、PCR配套緩沖液 東洋紡(上海)生物科技有限公司;DNA相對分子質量標準品 北京全式金生物技術有限公司;片段回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖 Sunbiotech公司;硝酸鹽還原試劑盒 青島海博生物技術有限公司;革蘭氏染色試劑盒 北京索來寶科技有限公司;其它試劑 均為分析純。

產堿性磷酸酶篩選培養基(g/L):葡萄糖10,硫酸銨0.5,氯化鈉0.3,氯化鉀0.3,MgSO4·7H2O 0.3,FeSO4·7H2O 0.03,MnSO4·H2O 0.03,CaCl2·2H2O 5,卵磷脂0.2,pH7.2,瓊脂粉20;堿性磷酸酶發酵培養基(g/L):葡萄糖10,硫酸銨0.5,氯化鈉0.3,氯化鉀0.3,MgSO4·7H2O 0.3,FeSO4·7H2O 0.03,MnSO4·H2O 0.03,CaCl2·2H2O 5,卵磷脂0.5,pH7.2;Modified Universal Buffer(MUB)(g/L)[16]:硼酸6.3,檸檬酸14.0,順丁烯二酸11.6,三羥甲基氨基甲烷12.1,氫氧化鈉19.52,pH11.0。

pH計 梅特勒-托利多儀器上海公司;雙目生物顯微鏡 日本OLYPUS公司;5415R型小型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;DH-4000B電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司;HNY-200B控溫搖床 上海志誠設備廠;PTC-200型PCR儀 德國Eppendorf公司;ChampGel 5500 凝膠成像儀 北京賽智生物技術有限公司;UV-1800型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株初篩 將采集的土壤樣品采用梯度稀釋(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8),分別取100 μL稀釋樣品涂布于產堿性磷酸酶篩選培養基[15],30 ℃培養7 d。每個梯度3平行,待平板長出單菌落后,測量透明圈直徑D(mm)和菌落直徑d(mm),計算D/d,挑選D/d值較大的菌株進行復篩。

1.2.2 菌株復篩 將初篩得到菌株接入堿性磷酸酶發酵培養基,在30 ℃,200 r/min條件下培養60 h,測定堿性磷酸酶活力,得酶活力最高的菌株,并編號進行后續研究。

1.2.3 磷酸酶活力測定 吸取1 mL發酵液,加入4 mL pH11.0的MUB緩沖液中,再加入0.025 mol/L對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)溶液1 mL后振蕩,37 ℃反應1 h,加入0.5 mol/L氯化鈣溶液1 mL和0.5 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL,振蕩后4000 r/min離心10 min,取上清液在420 nm比色[17]。

標準曲線的制作:取6支比色管,依次吸取1 g/L標準對硝基酚溶液0、1、2、3、4、5 mL分別裝于比色管中,用無菌水定容至5 mL。在每個比色管中再加入0.5 mol/L氯化鈣溶液1 mL、0.5 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL,振蕩后過濾或4000 r/min離心10 min,420 nm條件下測定吸光度。堿性磷酸酶活性以每分鐘OD420增加0.001為一個酶活力單位(U)。

1.2.4 菌株菌落形態對比觀察 將篩選得到的高產堿性磷酸酶菌株與其它產酶優勢菌株點接在產酶固體培養基上,對高產堿性磷酸酶菌株形態進行對比觀察。

1.2.5 生理生化鑒定 方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]和《伯杰細菌鑒定手冊》[19]。

1.2.6 分子生物學鑒定

1.2.6.1 引物的設計與合成 提取此菌株的總DNA,利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增,引物序列為Prime 935:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,Prime 936:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.2.6.2 PCR擴增 PCR反應體系為:10×PCR Buffer 2 μL,dNTPs(2 mmol/L)0.2 mmol/L,MgSO4(25 mmol/L)0.8 μL上游引物和下游引物各0.2 μmol/L,模板1 μg,KOD plus DNA聚合酶2 U,加無菌水至終體積為20 μL。

PCR反應條件為:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性15 s,56 ℃退火30 s,68 ℃延伸1.5 min,反應35個循環,68 ℃后延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.2.6.3 系統發育樹的構建 純化上述基因克隆產物后,送北京華大基因公司測序。將測序結果在GenBanK核酸序列數據庫進行序列比較,采用MEGA6軟件進行同源性分析,構建系統發育樹。

1.2.7 不同單因素對高產堿性磷酸酶菌株產酶活力的影響

1.2.7.1 不同碳源對高產堿性磷酸酶菌株產酶活力的影響 以產酶發酵培養基為對照,分別用10 g/L果糖、蔗糖、乳糖、木糖和麥芽糖代替堿性磷酸酶發酵培養基中的葡萄糖,30 ℃、200 r/min搖瓶發酵60 h,取其發酵液,分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.7.2 不同氮源對高產堿性磷酸酶菌株產酶活力的影響 以產酶發酵培養基為對照,在無硫酸銨的堿性磷酸酶發酵培養基中分別加入0.5 g/L氯化銨、蛋白胨、酵母浸出物、尿素、玉米漿和乙酸銨等,培養條件同上,分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.7.3 不同pH對高產堿性磷酸酶菌株產酶活力的影響 選擇pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11、12,培養條件同上,觀察其生長并分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.7.4 不同金屬離子對高產堿性磷酸酶菌株產酶的影響 以產酶發酵培養基為對照,研究鈣鹽對產堿性磷酸活性影響時,在無氯化鈣的堿性磷酸酶發酵培養基中分別加入5 g/L的碳酸鈣和磷酸鈣等;研究鈉鹽對產堿性磷酸活性影響時,在無氯化鈉的堿性磷酸酶發酵培養基中分別加入0.3 g/L的碳酸鈉、磷酸鈉、硫酸鈉和乙酸鈉;研究鉀鹽對產堿性磷酸活性影響時,在無氯化鉀的堿性磷酸酶發酵培養基中分別加入0.3 g/L的碳酸鉀、磷酸鉀、硫酸鉀和乙酸鉀等,培養方式同上,分別測定其堿性磷酸酶活力。

1.2.8 響應面實驗[20-24]為了確定最優水平組合發酵培養基,利用中心組合實驗方法進行響應面實驗設計。本實驗以果糖、尿素、pH和碳酸鈣四個因素的不同梯度為響應變量,以堿性磷酸酶活性為響應值,實驗因素水平設計見表1。

表1 實驗因素水平設計表Table 1 Factors and levels in the combination design

1.3 數據處理

每個實驗設置三個平行,利用MEGA6系統發育樹分析,菌株復篩和單因素實驗結果用orign 8.5作圖,響應面結果采用Design-Expert 8分析。

2 結果與討論

2.1 高產磷酸酶菌株的分離與篩選

利用初篩方法對土壤樣品進行初步篩選,結果見表2。得到3株透明圈較好的菌株,即菌株S377-1、S377-10、S377-11,其D/d值分別為1.92、1.89和2.25。

表2 產堿性磷酸酶菌株初篩結果Table 2 Screening results of alkaline phosphatase-producing bacterium

將初篩到的3株菌株進行酶活力測定,結果如圖1所示。相對高產堿性磷酸酶的菌株為菌株S377-11,其酶活力達到(3900±25) U,將其編號為S377。

圖1 菌株S377-1、S377-10和S377-11 產堿性磷酸酶酶活力的比較Fig.1 Comparison of alkaline phosphatase activity in strains of S377-1,S377-10 and S377-11

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株菌落形態對比觀察 為更加直觀突出菌株S377在產酶培養基上產酶優勢采用菌株形態對比觀察法,如圖2。從圖2可知,3株產酶優勢菌在產酶培養基上均能較快生長,其中S377-10菌落最大,形成透明圈直徑較大,但透明圈與菌落直徑比值較小,且產生透明圈效果不顯著;S377-1也可以水解產酶培養基上的有機磷,但產生透明圈效果較弱;S377菌落大小適中,產生透明圈較大,透明圈與菌落直徑比值最大且產生透明圈效果顯著。同時觀察可知,S377在產酶培養基上菌落呈圓形,表面粗糙、凸起,菌體表面微黃色。

圖2 產酶優勢菌在產酶培養基上菌落形態觀察Fig.2 The colonial morphology observation of enzyme production advantage bacterium on Enzyme production medium

2.2.2 生理生化鑒定 對菌株S377進行如下生理生化實驗,如表3。從表3可知菌種S377能夠利用D-葡萄糖、D-甘露醇、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和木D-糖產酸,其代謝產物能夠氧化乙醇和乙酸,能夠在GYC培養基上生長并產生透明圈,這些均說明該菌能夠產酸,但其氧化酶實驗、接觸酶實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、革蘭氏染色等均為陰性反應,說明S377可能是一株醋酸菌。

表3 S377菌株生理生化特性Table 3 Physical and biochemical characteristics of S377

2.2.3 分子生物學鑒定 提取S377菌株的基因組DNA。利用細菌16S rDNA通用引物進行擴增,獲得一條約1.5 kb的DNA序列(圖3)。

圖3 菌株S377基因組及16S rDNAFig.3 Genomic DNA and 16S rDNA of S377注:M表示1 kb DNA標準品。

通過菌株S377的16S rDNA序列與數據庫中的所有序列進行核苷酸同源性對比,構建16S rDNA序列相似性系統發育樹如圖4。由圖4可知,菌株S377與醋桿菌奧爾蘭亞種(Acetobacter orleanensis)同源性最高,同源性達到100%。因此,通過菌株菌落形態特征、生理生化特性及分子生物學等方面的鑒定,最終確定S377應歸屬于厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridium)、優桿菌科(Ubacterium)、醋酸桿菌屬(Acetobacter sp.)、醋桿菌奧爾蘭亞種(A.orleanensis)[25]。

圖4 菌株S377基于16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree for S377 based on 16S rDNA

2.3 不同環境因子對產酶活力的影響分析

2.3.1 碳源對產酶的影響 不同碳源對S377產堿性磷酸酶活力的影響結果如圖5所示。從圖5可知,以乳糖和木糖為碳源的發酵培養S377產堿性磷酸酶活性均低于對照組;以果糖、麥芽糖和蔗糖為碳源的發酵培養S377產堿性磷酸酶活性均高于對照組,其中以果糖為碳源的發酵培養基堿性磷酸活性最高,酶活力為(9100±130) U,大約是對照組的2.4倍。

圖5 碳源對菌株S377產堿性磷酸酶的影響Fig.5 Effect of carbon sources on the AKP production by strain S377

2.3.2 氮源對產酶的影響 不同氮源對S377產堿性磷酸酶活力的影響結果如圖6所示。從圖6可知,以氯化銨和酵母浸出物為氮源的發酵培養S377產堿性磷酸酶活性均低于對照組;以尿素、乙酸銨、玉米漿和蛋白胨為氮源的發酵培養S377產堿性磷酸酶活性均高于對照組,其中以尿素為氮源的發酵培養基堿性磷酸酶活性最高,酶活力為(12600±130) U,約為對照組的3.3倍。

圖6 氮源對菌株S377產堿性磷酸酶的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources on the AKP production by strain S377

2.3.3 不同初始pH對產酶的影響 不同pH對S377產堿性磷酸酶活力的影響結果如圖7所示。從圖7可知,S377產堿性磷酸酶活力在堿性環境下相對較高,而在中性或酸性條件下酶活力相對較低,pH10酶活力達到(11800±195) U。一般來說,醋酸菌大多偏好酸性環境,而此菌株在堿性條件下也可正常生長,并分泌高活性的堿性磷酸酶,這有待做進一步的研究。

圖7 起始pH對菌株S377產堿性磷酸酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on the AKP production by strain S377

2.3.4 不同金屬無機鹽離子對產酶的影響

2.3.4.1 鈣鹽對產酶的影響 不同鈣鹽對S377產堿性磷酸酶活力的影響結果如圖8所示。從圖8中可以看出,與對照組相比磷酸鈣對S377產堿性磷酸酶活力的影響不明顯,而碳酸鈣的影響則比較顯著,當加入碳酸鈣時酶活力達到(11200±132) U,約為是對照組的3倍。

圖8 不同鈣鹽對菌株S377產堿性磷酸酶的影響Fig.8 Effect of calcium salt on the AKP productionby strain S377

2.3.4.2 鈉鹽對產酶的影響 不同鈉鹽對S377產堿性磷酸酶活力的影響結果如圖9所示。從圖9中可以看出,磷酸鈉、硫酸鈉和乙酸鈉對S377產堿性磷酸酶活力影響均低于對照組,僅碳酸鈉高于對照組,其酶活力為(5190±129) U,約為是對照組的1.4倍。

圖9 不同鈉鹽對菌株S377產堿性磷酸酶的影響Fig.9 Effect of sodium salt on the AKP production by strain S377

2.3.4.3 鉀鹽對產酶的影響 不同鉀鹽對S377產堿性磷酸酶活力的影響結果如圖10所示。從圖10中可以看出,磷酸鉀和硫酸鉀對S377產堿性磷酸酶活力影響均低于對照組;碳酸鉀和乙酸鉀高于對照組,其中碳酸鉀對產酶活力影響最高,酶活力為(6300±162) U,約為是對照組的1.6倍。

圖10 不同鉀鹽對菌株S377產堿性磷酸酶的影響Fig.10 Effect of potassium salt on the AKP production by strain S377

從上述結果可以看出,鈣鹽、鈉鹽或鉀鹽,均是以碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸鉀為培養基成份時產堿性磷酸酶活力最高,這與其pH越高,其活性越高有關。碳酸根離子在發酵過程中有可能起到酸堿緩沖作用。東方醋酸桿菌在發酵過程中會產酸,而碳酸根離子在此過程中可以中和部分酸,使得發酵液中的酸堿環境保持的相對穩定的狀態下,從而堿性磷酸酶酶活力相對較高。但其具體作用機制有待進一步的研究。

2.4 響應面實驗的優化

總模型方差顯著(p<0.001),相關系數R2=0.9281,表明模型相關度較好;模型的失擬項不顯著(失擬項p值為0.0573>0.05),表明該模型精確度高,該模型的預測結果可以進行一定參考。各因素對S377堿性磷酸酶活力影響的次序為:尿素>pH>碳酸鈣>果糖。

對所得數據進行多元回歸分析,以堿性磷酸酶活力為Y,A為果糖,B為尿素,C為pH,D為碳酸鈣。得到四個因素與堿性磷酸酶活力之間的模擬方程為:

Y=20333.33-925A-1941.67B-1837.5C-1200.83D-303.75AB+222.5AC+356.25AD+697.5BC+506.25BD-525CD-1200A2-2400B2-1462.5C2-2591.25D2

響應面圖形是響應值對各實驗因子A、B、C、D所構成的三維空間的曲面圖,從響應面分析圖上可形象地看出各因素之間的相互作用。根據回歸方程得出不同因子的響應面分析圖及相應等值線圖結果見圖11。由圖11可較直觀地看出各因素對堿性磷酸酶存在一定的交互作用,各響應值均有最優的極值點。通過Design-Expert 8軟件進行系統優化分析,得到最大響應值的最佳配比條件為:果糖8.9 g/L,尿素0.4 g/L,pH9.2,碳酸鈣4.5 g/L,堿性磷酸酶活力的預測值為28335 U。利用此最優培養基配方進行驗證,在30 ℃,200 r/min搖瓶發酵60 h 堿性磷酸酶活性達到(28600±65) U。與預測值之間偏差較小,因此預測結果較為可信。

表4 響應面分析實驗結果Table 4 Response surface analysis test results

表5 以堿性磷酸酶活性為響應值的二次多項模型的方差分析Table 5 ANOVA for the quadratic model with alkaline phosphatase as response value

圖11 各因素之間的等高線和響應面圖Fig.11 The contour map and response graph between the various factors

3 結論

從土壤中篩選到一株高產堿性磷酸酶的菌株,經菌落形態對比觀察、生理生化鑒定以及分子生物學鑒定,最終確定此菌株為醋桿菌奧爾蘭亞種(A.orleanensis),編號S377。在單因素實驗基礎上通過響應面實驗,發現果糖、尿素、碳酸鈣及pH對S377堿性磷酸酶活力影響顯著且相互之間存在一定交互作用,產堿性磷酸酶的影響次序為尿素>pH>碳酸鈣>果糖。通過系統優化分析得到最佳發酵條件為:果糖(8.9 g/L)、尿素(0.4 g/L)、碳酸鈣(4.5 g/L)、pH(9.2),且在最優條件下堿性磷酸酶活力達到(28600±65) U。