福建海參內源微生物多樣性分析 及益生菌抑菌機理初探

李 智,黃曉山,鄭寶東,2,*,鄧凱波

(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350000;2.福建省海洋資源綜合加工及安全風險評估工程技術研究中心,福建福州 350000;3.中國愛爾蘭國際合作食品物質學與結構設計研究中心,福建福州 350000)

海參被譽為“海產八珍”之首,在我國具有悠久的養殖和食用歷史[1]。2013至2016年,福建海參產量年均增長14.1%[2]。產業規模的急速擴張帶來的養殖密度過高、水質不穩定等問題,導致海參染病率增加問題凸顯[3],且南北方養殖環境差異明顯,傳統的廣譜抗生素和化學藥物濫用現象嚴重制約了海參產業的健康、可持續發展[4-5]。而微生態制劑通過向飼料中添加活性微生物維持腸道平衡來改善宿主狀態,益生菌能與宿主、環境之間形成動態平衡,有利于宿主的健康生長[6-7],是一種綠色無污染的新型疾控手段。利用內源性益生菌較強的抗養殖環境脅迫能力和海參體內定植能力優勢,將有效提高其抗病效果。目前,有關海參微生物菌群分析的報道僅局限于遼寧、河北、山東等北方養殖地區[8]。近年來,國內海參養殖呈現“北參南養”的局面,福建是南方的主產區,針對福建海參微生物群落結構的研究和內源益生菌的開發具有重要的理論意義和經濟價值。

芽孢桿菌是一種微生態制劑的重要來源菌,其中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是中國農業部公布的12種飼料級微生物添加劑之一[9],而解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的研究表明其部分抗菌活性物質與枯草芽孢桿菌相似[10-11]。抗菌脂肽為芽孢桿菌中最常見的抑菌物質,主要為表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)與豐原素(Fengycin)[12-15]。抗菌脂肽對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌以及酵母菌均有抑制作用,具有抗菌范圍廣、安全高效、易降解、不易產生抗藥性等特點[16-18]。因此,抗菌脂肽在農業、食品、生物防治等領域顯示出重要的開發和應用前景[19-20]。Meen等[21]研究發現,Iturin和Fengycin對病原真菌生長起抑制作用,而Surfactin具有廣泛有效的抑菌活性。馬樹瑞等[22]從海參腸道中篩選出枯草芽孢桿菌HS-A38,從該菌株發酵液提取的粗品中分離出兩種直鏈脂肽類化合物,對致病菌有明顯抑制作用,但并未明確脂肽化合物的具體成分。田良等[23]研究發現,以海參消化道提取出的芽孢桿菌X3-3、X4-1及X4-5作為海參飼料添加劑,可顯著提高海參消化道內淀粉酶與蛋白酶活性,促進海參生長,但并未分離確定其功效成分。

因此,本研究擬采用16S rDNA序列比對和生物群落豐度分析手段研究福建海參腸道內源微生物,并以對海參致病菌的抑菌譜和抑菌能力為評價指標,篩選其中的潛在益生菌,對提取的抗菌脂肽類物質進行進一步評價分析,以探明其抑菌機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成年海參 取樣自福建省寧德市霞浦海參養殖場;2216E培養基:蛋白胨5.0 g,酵母膏1.0 g,磷酸高鐵0.1 g,陳海水1000 mL;2216E固體培養基另加15 g瓊脂;抽提細菌基因組DNA試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;硅膠板(Si60 F254) 默克化工技術(上海)有限公司;表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、豐原素(Fengyci) 標準品,美國Amresco公司。

BSA224S型分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;SPX-250型號恒溫培養箱 寧波江南儀器廠;Allegra X-30R Centrifuge高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;GI100DS型高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司;DHG-9145A型鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;FDU-1200型冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海參腸道菌群的分離純化 將取自福建霞浦養殖場的成年海參20只分為兩組,S1組為10只健康成年海參,S2組為10只體表病灶相似、質地松軟的病參的成年海參(圖1)。無菌條件下,75%(v/v)乙醇溶液擦拭體表后,用手術刀劃開海參體表取出整段腸道,無菌生理鹽水(0.9%(w/v)NaCl溶液)擦拭腸道外壁。然后將腸道剪碎后放入滅菌研缽,加入少量4 ℃的無菌生理鹽水研磨均勻。取研磨后的混合物倒入裝有2216E液體培養基的錐形瓶中,27 ℃的恒溫培養箱中靜置培養4 d。吸取1 mL混勻的培養物,使用無菌生理鹽水做梯度稀釋后,涂布于固體2216 E海水固體培養基上,每個梯度做三個平行,將涂布的平板放入27 ℃培養箱中靜置培養3 d。根據菌落形態、顏色及大小差異挑取菌落,分別在2216E固體培養基上劃線培養,對海參腸道菌株進行分離純化,并分別與甘油混合置于-80 ℃保存備用。

1.2.2 海參腸道菌株16S rDNA測序及菌株多樣性分析 取純化后菌株活化后,采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株基因組DNA,并采用27F和1492R引物進行16S rDNA序列擴增,經回收純化后將目標序列送至鉑尚生物工程(上海)股份有限公司測序。然后將拼接好的16S rDNA序列提交至NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GenBank核酸數據庫進行Blastn比對及同源性鑒定。采用ClustalW軟件進行多序列匹配排列,MEGA7軟件構建系統發育樹,并對潛在益生菌及致病菌進行多樣性分析。

1.2.3 海參腸道內潛在益生菌的體外抑菌實驗 采用牛津杯法[24]進行體外抑菌實驗,選取海參腸道內提取出的8株典型致病菌為指示菌,以其潛在益生菌為拮抗菌。將2個滅菌牛津杯置于均勻涂布了0.6 mL指示菌菌懸液(OD600=0.3)的2216E固體培養基上后,在其中一個牛津杯中加入200 μL的新鮮拮抗菌菌懸液(OD600=0.6),另一個牛津杯中加入200 μL的無菌生理鹽水做空白對照。將平板置于28 ℃培養箱中培養24 h后,測量抑菌圈直徑。

1.2.4 海參腸道內潛在益生菌的抗菌脂肽類化合物提取 采用酸沉淀法[]提取篩選后抗致病菌的益生菌內的脂肽類化合物。將新鮮的細菌發酵液在4 ℃下10000 r/min離心20 min,上清液用6 mol/L HCl調pH至2.0,放置于4 ℃冰箱過夜,10000 r/min離心20 min棄上清后,加適量甲醇對沉淀進行充分溶解,靜置0.5 h后10000 r/min離心10 min,上清液用微孔濾膜(D=0.22 μm)過濾后,置于60 ℃烘箱中至大部分甲醇揮發,對樣品進行凍干處理,得到脂肽類化合物的粗提物。

1.2.5 脂肽類粗提物對海參腸道典型致病菌的生長抑制作用 選取2株海參腸道內典型致病菌,以10%(v/v)的接種量接入100 mL 2166E液體培養基中,混合均勻后取10 mL培養液分別加入若干無菌空試管中。將提取出的脂肽類粗提物分別用甲醇稀釋至1 mg/mL制成粗提物溶液,分別取500 μL粗提物溶液加入上述致病菌培養液試管中,并以甲醇做空白對照,硅膠塞封口后于28 ℃中振蕩(110 r/min)培養12 h。使用比濁法測定菌液濃度,取0、1.5、4、6.5、9和12 h的菌懸液,在波長600 nm下測定菌懸液的吸光光度值。以其OD600值為縱坐標,培養時間為橫坐標,繪制生長抑制曲線。

1.2.6 抗菌脂肽粗提物薄層色譜(Thin-layer chromatography,TLC)分析 根據莊國宏[26]方法并稍作修改,將硅膠板置于110 ℃烘箱中活化30 min并確定點樣線后,在層析缸內加入層析劑(三氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸∶水=65∶15∶5∶2 (v/v/v))預展30 min。用少量甲醇溶解脂肽粗提物樣品及標準品,毛細管蘸取樣品在點樣線上點樣,兩樣品間距1.5 cm,待點樣處干燥后置于層析缸中展開,至硅膠板上端距離約1 cm處為展開終點。色譜結束后,將硅膠板置于裝有2 mL濃鹽酸(37.5%(v/v)HCl溶液)的小燒杯的密閉容器內,110 ℃烘箱中酸解2 h,取出后,硅膠板冷卻,將鹽酸吹凈,噴灑0.4%(v/v)茚三酮顯色劑,放入110 ℃烘箱中15 min進行顯色。

1.3 數據處理

本文所進行實驗均為三次重復結果,并采用Microsoft Excel 2010軟件進行顯著性分析,以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 海參內源菌株分離純化

將稀釋的種子培養混合物涂布于2216E平板培養基上并培養3 d后,通過肉眼和光學顯微鏡觀察菌落形狀、顏色、透明度、聚落等情況。從平板上挑選生長良好,未染雜的且具備一定差異性的菌落,將其進行平板劃線培養,純化后分別保存。本研究從海參腸道中分離純化共95株優勢菌株。

2.2 菌株16S rDNA鑒定與微生物群落結構分析

將95株優勢菌株的16S rDNA序列通過PCR手段擴增并純化后測序,使用16S rDNA,得到各菌株的拼接序列。將其提交到NCBI網站進行Blastn比對,根據序列相似性(>95%)確定菌株種屬。95株優勢菌株中,共分離出潛在益生菌31株,潛在致病菌株37株及普通腸道菌27株。并在屬水平上對健康參組(S1)和病參組(S2)中進行腸道附生微生物群落結構比較分析(見圖2)。

如圖2所示,從兩組海參腸道樣本中挑選的菌株由11個細菌屬組成,分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、海單胞菌屬(Marinomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、海桿菌屬(Marinobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、假海源菌屬(Pseudidiomarina)、弧菌屬(Vibrio)和Oceanisphaera菌屬。在S1中,以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬豐度最高,分別占菌株總數的36.96%和17.39%;在S2中,以假交替單胞菌屬和芽孢桿菌屬豐度最高,分別占菌株總數的30.61%和28.57%;S1中的海桿菌屬在S2中并未發現,S2中的弧菌屬和假海源菌屬在S1中并未發現;同時,S2中假交替單胞菌屬和不動桿菌屬的豐度遠高于S1。其中,芽孢桿菌屬被公認多為海參生長潛在益生菌,并廣泛用于微生態制劑開發中[23];有報道指出,假交替單胞菌屬、弧菌屬、不動桿菌屬、海桿菌屬和假單胞菌屬為海參潛在致病菌[27]。因此可見病參組中潛在致病菌豐度較高,而芽孢桿菌豐度較健康參組低。本研究海參樣品的微生物群落僅包含11個可檢測菌屬,與其他相關報道[27]中菌屬數量相比相對較少,這可能與樣品養殖環境有關。樣品取自福建霞浦吊籠養殖場,海參生活環境、飼料組分及微生態制劑的使用都會對海參腸道內微生物的組成產生影響[28]。

本研究同時發現福建養殖刺參與北方海參腸道優勢菌群具有一定差異。張文姬等從大連地區仿刺參腸道分離得到的細菌中,共有10個菌屬,優勢菌屬為假單胞菌屬、弧菌屬和芽孢桿菌屬,分別占總菌株數的33.3%、24.8%和22%;Zhang等[27]從日本海域刺參、底泥及海水中分離得到53個菌屬共計1133種菌株,分別屬于厚壁菌門、變形菌門及放線菌門,但并未分離到弧菌屬。

2.3 海參內源潛在益生菌的體外抑菌作用分析

根據2.2中S1組與S2組的微生物群落結構差異,選取不動桿菌屬、假單胞菌屬和海桿菌屬等3個屬共8株海參潛在致病菌為指示菌。其中,不動桿菌屬在病參組的含量高于健康參組,海桿菌屬、惡性假單胞菌(假單胞菌屬)為海參致病菌之一[27,29]。對海參內源潛在益生菌進行抑菌能力初篩后,選取10株以芽孢桿菌為代表的典型益生菌作為拮抗菌株,采用牛津杯法對其體外抑菌能力進行測評(表1)。

表1 福建海參內源益生菌對致病菌的抑菌作用Table 1 Bactriostasis of endogenous probiotics on pathogens of Fujian sea cucumber

以抑菌圈平均直徑和抑菌譜為雙重指標,對各拮抗菌株的抑菌能力比較可知,抑菌種數達到5株及以上的典型益生菌共有四株,分別為YD1、YK5、YK7和YY8,其中YK7和YY8的抑菌圈平均直徑僅為11.76和11.22 mm,抑菌效果相對較差。而YK9的抑菌圈平均直徑雖達13.95 mm,但抑菌種數僅為3株,抑菌譜較窄。因此,綜合比較篩選出海參附生芽孢桿菌YD1和YK5的相對抑菌能力較強,對各指示菌的抑菌圈形態見圖3。

圖3 內源益生菌YD1和YK5對海參致病菌抑制作用的抑菌圈展示Fig.3 Illustration of inhibition zone of endogenous probiotics YD1 and YK5 on pathogens from Fujian Apostichopus japonicus

經16S rDNA序列擴增及測序確定YD1和YK5分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(圖4)。

圖4 福建海參內源芽孢桿菌YD1 和YK5種屬鑒定系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of endogenous Bacillus YD1 and YK5 from Fujian Apostichopus japonicus注:采用MEGA 7.0軟件基于Tamura-Nei模型的 最大似然法作樹,Bootstrap value=500。

2.4 內源芽孢桿菌YD1和YK5脂肽類粗提物對典型致病菌的生長抑制作用

提取具有較強抑菌能力的解淀粉芽孢桿菌YD1和枯草芽孢桿菌YK5的脂肽類化合物,并對粗提物的抑菌作用進行對比研究,以本研究分離的典型致病菌惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZE4和ZE5為指示菌,以甲醇為空白對照組,抑菌結果如圖5所示。與甲醇對照組結果比較,隨著培養時間的延長,從9 h開始,ZE4菌懸液的OD600值呈現出顯著差異(p<0.05)(圖5A和5C),YD1和YK5的脂肽提取物對ZE4的生長產生明顯的抑制作用;從6.5 h開始,ZE5菌懸液的OD600值呈現出顯著差異(p<0.05)(圖5B和5D),YD1與YK5的脂肽提取物對ZE5的生長產生明顯的抑制作用。結果顯示,雖然抑菌效果有差異,但YD1和YK5的脂肽類粗提物對ZE4及ZE5的生長均具有抑制作用。該結果表明,解淀粉芽孢桿菌YD1和枯草芽孢桿菌YK5的脂肽類代謝產物有抑制致病指示菌生長的效果。

圖5 內源性益生菌脂肽類粗提物對致病菌的生長抑制作用Fig.5 Growth inhibition effects of lipopeptide extraction of endogenous probiotics on pathogens注:(A)、(C)為以ZE4為指示菌,(B)、(D)為以ZE5為指示菌;“*”表示與同時間空白組 結果差異顯著(p<0.05);“**”表示與同時間空白組結果差異極顯著(p<0.01)。

2.5 薄層色譜(TLC)分析

由芽孢桿菌YD1和YK5脂肽類代謝產物的薄層色譜結果可知(圖6),使用茚三酮對硅膠板進行噴灑染色并放入烘箱烘干后,YD1和YK5在對應位置處(點A)均呈現為單一的褐色斑點,樣品與標準品Surfactin的相對遷移率Rf基本一致(Rf=0.75)。Fengycin、Iturin與Surfactin的相對分子質量均在1000～1500范圍內[30],Fengycin和Iturin標準品也在A處附近呈現明顯的褐色斑點,說明其相對遷移率與Surfactin及樣品脂肽的基本一致?？沙醪秸J定兩菌株的代謝產物含有Fengycin、Iturin、Surfactin中的一種或多種脂肽類物質,且均為含有親水性成分的環脂肽類化合物[31]。

圖6 芽孢桿菌YD1和YK5脂肽類代謝產物TLC結果Fig.6 Thin-layer chromatogram of lipopeptides metabolized by Bacillus YD1 and YK5

3 結論

本研究從福建海參腸道中提取95株優勢菌株,其中,共分離出潛在益生菌31株,潛在致病菌株37株及普通腸道菌27株。通過微生物群落結構分析發現,病參腸道中假交替單胞菌屬和不動桿菌屬等典型致病菌豐度較高,芽孢桿菌豐度較低,是正常組海參與患病組海參的主要差異,可能是導致福建海參疾病的原因之一。

使用牛津杯法抑菌實驗,以抑菌能力為指標篩選出兩株抑菌效果明顯且抑菌譜較廣的菌株,經16S rDNA測序及比對確定其為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)YD1和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)YK5。研究了上述兩株芽孢桿菌的脂肽類代謝產物對海參內源致病菌的抑菌作用,發現其對致病菌生長均有良好的抑制作用,證明了其抑菌機理與脂肽類化合物有關,且為含有親水性成分的環脂肽類化合物。

本研究對構建新型益生菌,開發新型微生態制劑以及海參養殖產業的健康,可持續發展提供了重要的理論依據。