結合預處理方法的酶法 制備美藤果肽工藝的優化

梁鉆好,林鳳英,黎 攀,馬曉偉,杜 冰,*,沈 睿

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510627;3.廣州市食品藥品監督管理局食品監督執法分局,廣東廣州 510130)

美藤果,又被稱為南美油藤(PlukenetiavolubilisLinneo)、印加果(Sachainchi)、星油藤,屬大戟科多年生木質藤本植物,生長于海拔200～1500 m的南美洲安第斯山脈地區熱帶雨林[1]。其果實形狀像星星,種仁可食用,富含油脂(45%～60%)和蛋白質(27%～30%)[2,3]。2009年引種中國云南。雖然美藤果是秘魯、厄爾瓜多等地區的傳統食物,但國內外關于美藤果的研究并不多。1992年Hamaker等[2]對美藤果基本成分、蛋白氨基酸和油脂脂肪酸組成進行了初步分析,此后直到近10年國外才開始陸續更新對美藤果的研究[3-7]。2013年美藤果油正式被批準為我國新資源食品,因此近5年國內學者圍繞美藤果油展開了一系列基礎研究[8-10]。但相比美藤果油,美藤果蛋白的受關注程度更低。據目前國外為數不多的研究報道顯示,美藤果的蛋白含量僅次于大豆,由18種氨基酸組成,與公認為容易消化吸收的大豆蛋白對比,賴氨酸和亮氨酸含量偏低,但含硫氨基酸、酪氨酸、色氨酸和蘇氨酸含量遠高于大豆蛋白和其他油料作物,根據FAO/WHO/UNU評分模式屬于優質植物蛋白[2,5]。另外,美國Foodnavigator的最新報道[11]顯示,美藤果蛋白的PDAAC(蛋白質消化率校正氨基酸記分)為0.87(滿分為1.0,乳清蛋白為1.0),是一種營養均衡、容易吸收的優質植物蛋白。2016年美藤果蛋白被批準為我國的新食品原料,因此在國內的研究報道更是屈指可數,但這種優質的美藤果蛋白必將引起廣泛的關注[12]。

美藤果的開發目前主要停留在油脂方面,榨油后得到的果粕殘渣含有約60%的高價蛋白質,可作為開發植物多肽的新原料。植物多肽因具有營養和調節機體生理功能的雙重功效被廣泛關注,如大豆多肽具有明顯的抗疲勞、提高營養物質的吸收率[13]、抑制乳腺癌和前列腺細胞增殖[14]等多種特殊功效;花生多肽具有抗氧化[15]、抗高血壓[16]的作用。由于植物中富含蛋白質的原料不多,一般以豆類多肽為主,但由于部分人對某些豆類過敏,推廣受限。目前市場上的植物多肽產品以大豆多肽、燕麥多肽為主,產品品種單一,原料稀缺。而美藤果種仁的蛋白含量僅次于大豆,遠高于燕麥,果粕中的蛋白質含量更是高達60%[17];再者,鑒于美藤果油的高不飽和性和高含油率,美藤果提油是以冷壓榨方式提取的,果粕中的蛋白質質量未受到影響;另外,作為新食品原料,美藤果蛋白及其附加產品前景可觀。因此,本文旨在利用美藤果粕開發高質量植物多肽,篩選合適的預處理方式提高水解效果,通過響應面實驗優化酶法制肽工藝,并分析肽液分子量分布狀況。一方面有助于開發深加工、高附加值的美藤果產品,實現原料的綜合利用;另一方面可以加速我國肽產品市場的發展,前景可觀。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美藤果粕(低溫壓榨提取油脂后得到的果粕) 普洱聯眾生物資源開發有限公司提供;胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶 廣州市齊云生物技術有限公司;L-酪氨酸、甘氨酸(均為標準品,HPLC≥98%) 上海易蒙斯化工科技有限公司;十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、吐溫-80、甜菜堿、亞硫酸鈉(均為食品級) 河北百味生物有限公司。

1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;A300全自動氨基酸分析儀 德國曼默博爾;KQ-250TDV高頻數控超聲波清洗器 賽多利斯科學儀器;UV3010紫外可見分光光度計 日本日立有限公司;HH·S21-4恒溫水浴鍋 上海悅豐儀器儀表有限公司;PHS-3D PH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美藤果粕基本成分分析 總蛋白(粗蛋白)測定:參照GB/T 5009.5-2016的凱氏定氮法;粗脂肪測定:參照GB/T 5009.6-2016的索氏抽提法;總糖測定:苯酚硫酸法;水分測定:參照GB/T 5009.3-2016的直接干燥法;灰分測定:參照GB/T 5009.4-2016的馬弗爐法。

1.2.2 美藤果粕的脫脂處理 美藤果粕粉碎后按1∶6的料液比加入石油醚,60 ℃回流提取6 h,過濾,濾渣于60 ℃烘干除去剩余石油醚,粉碎,過100目篩備用。

1.2.3 酶解工藝流程 調料→預處理→調節pH→酶解處理→滅酶→測定水解度

1.2.4 蛋白酶種類的確定 選用胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和復合蛋白酶對美藤果蛋白進行水解制肽。脫脂美藤果粕按1∶20的料水比調配,然后分別添加4000 U/g的蛋白酶,按各酶的最佳作用pH和溫度酶解3 h,以蛋白水解度為指標,確定最優酶種。

1.2.5 蛋白質預處理方式的確定 固定反應條件為:料水比1∶20、預處理溫度50 ℃、預處理時間15 min,考察添加Na2SO3(添加量:0、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%)、添加表面活性劑(表面活性劑類別:十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、吐溫-80、甜菜堿,均按0.4%的濃度添加)及超聲處理(超聲頻率:20、40、60、80 kHz)三種預處理方式對美藤果粕蛋白水解度的影響。然后調節pH(根據實驗確定選用堿性蛋白酶,最適pH=9.0),加入4000 U/g蛋白酶,50 ℃下酶解3 h,85 ℃滅酶15 min,酶解液用于測定水解度。

1.2.6 美藤果蛋白的酶解

1.2.6.1 單因素實驗 在最優的預處理方式(50 ℃,40 Hz超聲15 min)下對美藤果粕進行預處理后,調節pH至9.0,采用酶解效果最佳的堿性蛋白酶對蛋白進行酶解,酶解結束后在85 ℃滅酶15 min,酶解液用于測定水解度。固定反應條件為加酶量4000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h,考察不同料水比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)對美藤果蛋白水解度的影響;固定反應條件為料水比1∶20、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h,考察堿性蛋白酶的不同加酶量(2000、4000、6000、8000、10000 U/g)對美藤果蛋白水解度的影響;固定反應條件為料水比1∶20、加酶量4000 U/g、酶解時間3 h,考察不同酶解溫度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)對美藤果蛋白水解度的影響;固定反應條件為料水比1∶20、加酶量4000 U/g、酶解溫度50 ℃,考察不同酶解時間(1、2、3、4、5、6、7 h)對美藤果蛋白水解度的影響。進行單因素實驗,考察各因素變量對美藤果蛋白水解度的影響。

1.2.6.2 響應面優化實驗 根據Box-Behnken中心組合設計原理,在單因素實驗的基礎上,根據各因素對美藤果蛋白水解度的影響,選取3個主要影響因素作為自變量,以水解度為響應值,設計3因素3水平15個實驗點的響應面分析實驗,確定美藤果蛋白水解的最佳工藝條件,因素與水平設計見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.7 蛋白酶活力的測定 參照GB/T 23527-2009的福林法進行測定。

1.2.8 蛋白水解度的測定 水解度的測定采用茚三酮法[18]

式中:DH為蛋白水解度;H為水解斷裂的肽鍵數目;Htot為總肽鍵數目(用全自動氨基酸測定儀測定)。

1.2.9 肽相對分子質量分布 參考GB/T 22492-2008附錄A《大豆肽相對分子質量分布的測定方法》,采用高效凝膠過濾色譜法測定美藤果肽的相對分子質量分布情況,色譜柱為TSK G2000SWXL(5 μm,300 mm×7.8 mm)凝膠色譜柱。

1.3 數據分析

采用Design-expert V8.0.6進行響應面分析,SPSS Statistics 17.0作統計學分析。

2 結果與分析

2.1 美藤果粕基本成分分析

美藤果粕的基本組分及含量見表2。由表可知,美藤果粕的蛋白含量較高,可以用于開發植物多肽的重要原料。

表2 美藤果粕的基本成分Table 2 Basal component of Sacha inchi

2.2 酶種類對美藤果蛋白水解度的影響

蛋白的活性、最適反應條件和對美藤果蛋白的水解度如下表3。其中堿性蛋白酶對美藤果蛋白的水解能力顯著(p<0.05)高于其他5種蛋白酶,各種蛋白酶水解能力次序為:堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶、復合蛋白酶>胃蛋白酶、中性蛋白酶>胰蛋白酶。

表3 蛋白酶活性、最適反應條件及水解效果Table 3 Protease activity,optimum reaction conditions and hydrolysis effect

堿性蛋白酶來自枯草桿菌[19],屬內切蛋白酶,可裂解谷氨酸、賴氨酸、色氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺酸羧端的肽鍵,且當N-端為疏水性氨基酸時裂解速度更快[20-21]。另外,相比中性和酸性溶液,美藤果蛋白在堿性溶液中具有更高的溶解度[22],因此在pH9.0的條件下用高活性的堿性蛋白酶作用,相比pH在中偏酸性條件下具有高活性的酸性(胃蛋白酶)和中性(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶)蛋白酶,美藤果蛋白的水解度較高。雖然胰蛋白酶的最適pH也是堿性,但胰蛋白酶是專一識別賴氨酸和精氨酸殘基的肽鏈內切酶,而美藤果蛋白的氨基酸組成中賴氨酸是輕微缺乏的,這兩種氨基酸只占美藤果蛋白的9.8%[2],因此同樣在堿性條件下,胰蛋白酶對美藤果蛋白的水解能力較差。

2.3 預處理方式對美藤果蛋白水解度的影響

根據2.2酶種類的篩選,確定堿性蛋白酶為美藤果粕水解所用酶,以下實驗均采用堿性蛋白酶進行酶解。

2.3.1 Na2SO3的添加對美藤果蛋白水解度的影響 在加熱情況下,蛋白質球狀結構展開,二硫鍵暴露,還原劑Na2SO3的加入可裂解二硫鍵,促進蛋白質水解[23]。如圖1所示,相比對照組(Na2SO3添加量為0),少量Na2SO3的添加(0.25%)能使堿性蛋白酶對美藤果蛋白的水解度提高10%,但Na2SO3的增加對美藤果蛋白水解度影響不明顯。

圖1 亞硫酸鈉添加量對美藤果蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of sodium sulfite addition on degree of hydrolysis of Sacha inchi protein

在蛋白質功能性修飾的應用中,化學試劑Na2SO3被用于提高大豆蛋白的溶解性[24]。Liu等[23]的研究跟本論文研究結果一致,證實了加入Na2SO3可促進大豆蛋白的水解效果,在50～100 μmol/L Na2SO3的添加量中,氮酸和小分子肽含量均有顯著增加,以100 μmol/L的濃度下,小分子肽含量增加最大。多肽之間是通過二硫鍵鏈接的,蛋白質之間也是通過二硫鍵聚合的,Na2SO3可裂解這些二硫鍵,從而促進蛋白質水解。基本上,蛋白酶能迅速作用于不溶性蛋白顆粒,把松散地結合在表面的多肽水解下來,但蛋白質內部更致密更核心的多肽水解較慢[25]。Liu等[23]研究還發現Na2SO3的加入使溶液中SH基團含量增加,即二硫鍵被裂解,進一步證實了Na2SO3是通過裂解二硫鍵加速水解蛋白質內部緊密連接的多肽的。

2.3.2 表面活性劑種類對美藤果蛋白水解度的影響 如圖2,在4種表面活性劑中,只有陽離子表面活性劑CTAB能顯著提高美藤果蛋白水解度,非離子表面活性劑吐溫-80對水解度影響不大,陰離子表面活性劑SDS和兩性表面活性劑甜菜堿的加入反而會降低美藤果蛋白的水解能力。

圖2 表面活性劑對美藤果蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of surfactants on degree of hydrolysis of Sacha inchi protein

酶屬于蛋白質,表面活性劑的加入,可改變蛋白酶的二級結構(α螺旋、β折疊等),從而改變蛋白酶活力,或抑制或提高,這與表面活性劑的類型以及酶的種類有關[26]。CTAB和SDS對美藤果蛋白水解能力的截然相反的作用,可能的原因是陰離子和陽離子表面活性劑添加到酶解液中,分別與蛋白酶結合形成絡合物,對蛋白酶結構產生影響,陽離子表面活性劑與堿性蛋白酶結合時激活了酶的活性,陰離子表面活性劑卻抑制了酶的活性。非離子表面活性劑通常與酶的結合力較弱[26],楊慶利等[27]研究發現配制洗滌劑常用的非離子表面活性劑脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO9)、烷基酚醚(TX-10)、甲基乙基醚(MEE)、吐溫-80、烷基糖苷12-14(APG12-14)和椰子油脂肪酸二乙醇酰胺(6501)中,只有AEO9可顯著增強液體蛋白酶活性,其他的非離子表面活性劑對液體蛋白酶活性影響不明顯。本論文研究也發現吐溫-80對堿性蛋白酶水解美藤果蛋白影響不大。但熊丹等[26]則有不同發現,他們認為在水分含量較低的情況下,吐溫-80能顯著提高胰酶催化牛血清白蛋白水解能力,但在高水分含量時,則沒有明顯影響。這進一步表明非離子表面活性劑對蛋白酶活力的影響與蛋白酶種類有關。

2.3.3 超聲處理對美藤果蛋白水解度的影響 如圖3,20 Hz超聲處理15 min,美藤果蛋白水解度就由8.24%±0.14%提升到11.05%±0.15%,20～80 Hz的超聲處理均能有效提高美藤果蛋白的水解能力,其中40 Hz的提高率最明顯,達50%以上。

圖3 超聲處理對美藤果蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment on hydrolysis degree of Sacha inchi protein

酶解反應往往由于酶與底物位點接觸頻率低,導致反應時間延長或反應效率低。有許多研究表明,超聲技術可提高酶解反應效率[28-29]。Zhou等[29]研究超聲技術對中性蛋白酶和玉米谷物蛋白分子結構的影響,發現超聲使蛋白質的緊密空間結構舒展開,部分殘基暴露,與蛋白酶接觸的機會增大,從而縮短酶解時間。丁青芝等[30]研究發現,用超聲處理過的蛋白酶對菜籽蛋白進行酶解,或用蛋白酶酶解超聲處理過的菜籽蛋白,或超聲與酶解同時處理菜籽蛋白,3種處理方式與比常規酶解相比,均能明顯提高酶解液的ACE抑制率,同時肽得率也顯著提高,超聲處理過程中,超聲的空化作用會破壞蛋白原料和蛋白酶結構,一定頻率的超聲預處理后,美藤果蛋白結構會變得疏松,蛋白酶的作用位點暴露,有利于加速酶和美藤果蛋白底物的結合。但當超聲頻率過大時,美藤果蛋白結構被破壞程度加大,而且超聲對蛋白質化學鍵的斷裂缺乏選擇性,從而導致蛋白水解度下降。丁青芝等[30]關于超聲處理菜籽蛋白原料中超聲功率對蛋白水解度的影響也有類似的結論。

2.4 酶解技術在美藤果肽制備中的應用

Na2SO3或表面活性劑處理對堿性蛋白酶水解美藤果蛋白的水解度最大提高率分別為11%和12.4%(圖1和圖2),而超聲處理對美藤果蛋白水解度的最小提高率就已經有34.1%,最高可達50%以上(圖3),即超聲處理能更有效地提高堿性蛋白酶水解美藤果蛋白的能力。因此以下的酶解單因素實驗和優化實驗均先采用40 Hz超聲處理15 min。

2.4.1 料水比對美藤果蛋白水解度的影響 如圖4可見,隨著水量增加,美藤果蛋白水解度也顯著增加,當料水比增加到1∶15時,水量的變化對蛋白水解度影響不大。但當水量增加到一定程度,即1∶30時,蛋白水解度反而急劇下降,這與酶濃度的過度稀釋有關。水量增加到一定程度,酶濃度被稀釋,酶與底物接觸的機率極大降低,水解能力下降。但圖4中,料水比在1∶15～1∶25較大一個范圍內變化時,水解度變化不顯著,即在該范圍內料水比對美藤果蛋白水解度的影響并不顯著。因此最適料水比可在這個范圍內變動。

圖4 料水比對美藤果蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of material water ratio on hydrolysis degree of Sacha inchi protein

2.4.2 加酶量對美藤果蛋白水解度的影響 加酶量對美藤果蛋白水解度如圖5,低酶量時,酶量的增加促進蛋白水解度的急劇增加;當酶量增加到4000 U/g時,繼續加大酶量,蛋白水解度增加幅度略有減少;當酶量翻倍達到8000 U/g時,蛋白水解度達到較大值,13.67%±0.18%,曲線趨于平緩。考慮到經濟情況,最適加酶量選擇為8000 U/g。

圖5 加酶量對美藤果蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme amount on hydrolysis degree of Sacha inchi protein

2.4.3 酶解溫度對美藤果蛋白水解度的影響 蛋白水解過程中溫度是一個重要的影響因素,溫度過低,酶空間結構不能充分打開或暴露;溫度過高,蛋白和酶都有可能會變性,導致水解度降低。圖6可見,最佳酶解溫度為50 ℃。

圖6 酶解溫度對美藤果蛋白水解度的影響Fig.6 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis degree of Sacha inchi protein

2.4.4 酶解時間對美藤果蛋白水解度的影響 從圖7可知,酶解時間對美藤果蛋白水解度有顯著的影響,1～5 h期間,蛋白水解度與酶解時間之間呈線性關系,而且該直線的斜率高達1.845,即酶解時間為1～5 h變化時,蛋白水解度的加速度為1.845 U/(g·h)。5 h的美藤果蛋白水解度幾乎是1 h的2倍,此后增加酶解時間,水解度變化不大。因此,最佳酶解時間為5 h。

圖7 酶解時間對美藤果蛋白水解度的影響Fig.7 Effect of enzymolysis time on hydrolysis degree of Sacha inchi protein

2.4.5 響應面優化實驗 圖4顯示料水比為1∶15～1∶25時,美藤果蛋白水解度最高,但沒有顯著差異,即在該范圍內料水比因素對水解度影響不大,因此只選取加酶量、酶解溫度、酶解間3個影響因素作為自變量,以蛋白水解度為響應值,進行響應面優化實驗,實驗結果見表4。

表4 響應面設計與實驗結果Table 4 Response surface design and experimental results

表5 回歸方程模型方差分析Table 5 Regression equation model analysis

圖8的響應曲面可較直觀地了解美藤果蛋白酶解工藝中加酶量、酶解溫度、酶解時間3個因素之間交互作用對蛋白水解度的影響。由三組圖對比可知,加酶量和酶解時間對美藤果蛋白水解度的影響均較為顯著,表現為圖8B曲面最為陡峭。

圖8 交互作用對蛋白水解度影響的響應曲面Fig.8 Response surface of interaction effects on proteolysis

由回歸方程可知,美藤果肽酶解制備的最優工藝條件為:加酶量7646.07 U/g,酶解溫度51.27 ℃,酶解時間6 h。在該條件下,美藤果蛋白水解度的理論值可高達18.06%。考慮到實際操作將其工藝條件優化為:加酶量7600 U/g,酶解溫度52 ℃,酶解時間6 h。在此條件下進行驗證實驗,得到美藤果蛋白平均水解度為18.21%,與理論預測值相比相對誤差僅為0.83%。因此,采用Box-Behnken設計優化得到的美藤果肽酶解制備工藝條件可靠,具有實用價值。優化后的超聲輔助酶法制肽,其水解度相比Rosana Chirinos等[17]采用堿性蛋白酶提取美藤果粕蛋白得到的7.8%水解度要高得多。

2.5 肽分子量分布

美藤果粕經超聲處理和堿性蛋白酶水解后得到的蛋白酶解液即為美藤果蛋白肽。通過測定分子量分布(表6),發現美藤果蛋白酶解得到的肽物質大多為分子量<1000 Da的寡肽(占94.64%),并有50%以上分布在180～500 Da之間,分子量在2000 Da以上的大分子多肽只占1.97%。這表明美藤果粕和水以1∶20的比例混合后在40 Hz下超聲處理15 min,再用7600 U/g的堿性蛋白酶在52 ℃下酶解6 h的酶解效果較好,水解度高,得到的肽液分子量小而集中。

圖9 美藤果多肽的色譜圖Fig.9 Polypeptide chromatogram of Sacha inchi

表6 美藤果肽的相對分子質量分布Table 6 Relative molecular weight distribution of Sacha inchi polypeptide

3 結論

本研究采用酶解技術對美藤果肽的制備條件進行優化,并測定制得的肽相對分子質量,得出如下結論:

各種蛋白酶對美藤果粕的水解能力次序為:堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶、復合蛋白酶>胃蛋白酶、中性蛋白酶>胰蛋白酶,堿性蛋白酶最適宜用于美藤果肽的制備。

分別采用3種預處理方式:添加Na2SO3、添加表面活性劑、超聲處理對酶法制備美藤果肽進行預處理。添加0.15%～0.45%的Na2SO3均能提高蛋白水解度,其中0.25%的添加量可使水解度提高10%;CTAB、SDS、吐溫-80、甜菜堿四種表面活性劑中只有CTAB能顯著提高美藤果蛋白水解度,提高率為12%;超聲處理是三種預處理方式中提高蛋白水解度最明顯最高效的方法,40 Hz超聲處理可使蛋白水解度比單獨酶解處理的提高50%以上。

超聲輔助酶法制備美藤果肽最優工藝條件為:40 Hz超聲處理美藤果粕15 min后添加7600 U/g堿性蛋白酶,52 ℃下酶解6 h,得到美藤果蛋白水解度為18.21%,肽液為相對分子量集中在<1000 Da的寡肽(占94.64%)。

預處理方式在食品加工中有重要應用,對原料進行適當的預處理可大幅提高有效成分的溶出或增進水解效果。美藤果粕作為提油后的殘渣,富含優質蛋白質(約60%),開發成為新的植物多肽原料具有廣泛的應用價值。而且美藤果果水解后得到的肽液主要為小分子肽,其功能特性和臨床效果值得深入探究。