超聲-微波協(xié)同提取杜仲樹(shù)皮 及樹(shù)葉中的黃酮類(lèi)化合物

王 穎,李 榮,姜子濤,閆長(zhǎng)旭,李婷婷,梁露露,何海軍

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)又名膠木、思仲、思錦樹(shù)等,為單科單屬落葉喬木,是我國(guó)特有珍稀瀕危二類(lèi)保護(hù)植物及第三紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)孑遺植物[1-2]。有研究表明,杜仲葉與皮的化學(xué)成分基本相同,藥效類(lèi)似[3]。杜仲含有酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)及杜仲膠等多種化合物[4]。黃酮含量的高低是判斷杜仲生藥及其產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)?，F(xiàn)已從杜仲中分離鑒定多種黃酮類(lèi)化合物,比如槲皮素、蘆丁、黃芩素、山奈酚等[5-6]。而杜仲膠是結(jié)構(gòu)為反式聚異戊二烯的一種天然高分子材料,主要存在于樹(shù)皮、葉和種子中[7]。

超聲波輔助提取及微波輔助提取是近年來(lái)適用于以天然產(chǎn)物為原料提取功能因子的新技術(shù)[8-10]。超聲波因其空化作用而產(chǎn)生高強(qiáng)度機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng),具有細(xì)胞破碎、增加穿透性與加速質(zhì)量傳遞等優(yōu)勢(shì);微波輔助提取則是通過(guò)產(chǎn)生高效內(nèi)熱和電介質(zhì)熱而提高提取效率、減少提取時(shí)間并降低料液消耗[11-13]。盡管以上兩種提取技術(shù)各具優(yōu)點(diǎn),但超聲波輔助提取的熱效應(yīng)較弱,通常在提取過(guò)程中無(wú)法達(dá)到提取所需高溫;微波輔助提取則存在加熱不均等問(wèn)題,這些缺點(diǎn)限制了這二種方法的進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。而采用超聲-微波協(xié)同提取方法(UMAE)可實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)[14-15],即超聲波產(chǎn)生的振蕩和攪拌作用能有效彌補(bǔ)微波傳熱、傳質(zhì)不均等缺陷,而微波極佳的熱效應(yīng)能有效地彌補(bǔ)超聲波產(chǎn)熱不足的問(wèn)題。近年來(lái),UMAE在提取多糖、多酚、黃酮等方面已有部分報(bào)道[16-17]。Cheng等[16]提取了雞血藤總黃酮,付洋等[17]發(fā)現(xiàn)此法用于荷葉總黃酮的提取效率明顯高于加熱提取等傳統(tǒng)方法。

本文采用UMAE對(duì)杜仲樹(shù)皮及樹(shù)葉中的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了提取,利用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。此外,利用掃描電子顯微鏡(SEM)[18]對(duì)UMAE提取中杜仲的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察,為此法的高效提取機(jī)理提供了解釋依據(jù)。同時(shí),利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)杜仲樹(shù)皮與樹(shù)葉黃酮類(lèi)化合物成分進(jìn)行初步定性和含量比較,為開(kāi)發(fā)利用杜仲黃酮奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲樹(shù)皮與樹(shù)葉 產(chǎn)地陜西,粉碎過(guò)40目篩后置陰涼處備用;蘆丁 中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度≥98%);綠原酸 上海晶純生物科技有限公司(純度大于99%);沒(méi)食子酸 天津一方科技有限公司(純度≥98%);槲皮苷、山奈酚、阿魏酸、槲皮素 阿拉丁試劑公司(純度≥98%);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基 美國(guó)Sigma試劑公司;D101大孔樹(shù)脂 天津南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng);甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純) Sigma-Aldrich Co.(中國(guó)公司);無(wú)水乙醇、石油醚(沸程30～60 ℃和60～90 ℃)、硝酸鋁、亞硝酸鈉等 均為國(guó)產(chǎn)市售分析純;蒸餾水、超純水 實(shí)驗(yàn)室自制。

CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;Alpha-1500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司;JSM-IT300型掃描電子顯微鏡 日本電子公司;1260 Series高效液相色譜儀,色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó)Agilent公司;FD-5冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;RE52-86A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);Vortex-Genie 2渦旋振蕩器 美國(guó)科學(xué)工業(yè)有限公司;AUW120D電子天平 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲膠的分離

1.2.1.1 杜仲膠的分離對(duì)杜仲黃酮得率的影響 分別稱(chēng)取3.0 g杜仲樹(shù)皮粉末和杜仲葉粉末進(jìn)行脫膠,按照液料比50∶1 (mL∶g)分別加入150 mL石油醚(沸程60～90 ℃),利用超聲-微波協(xié)同萃取儀,設(shè)置微波功率400 W,在開(kāi)啟超聲波(50 W/40 kHz)的條件下,溫度70 ℃,設(shè)定提取時(shí)間30 min,趁熱對(duì)提取液進(jìn)行減壓抽濾,對(duì)脫膠的杜仲樹(shù)皮粉末和杜仲葉粉末進(jìn)行干燥,備用。由于杜仲膠于石油醚中的溶解度在低溫環(huán)境下急劇下降[19],因此濾液置于-20 ℃冰箱冷凍3 h可析出杜仲膠,濾去溶劑即得杜仲膠,干燥稱(chēng)重得杜仲膠質(zhì)量,其中杜仲膠含量(%)=m×100/M,其中:m為杜仲膠的質(zhì)量(g);M為杜仲粉末質(zhì)量(g)。各稱(chēng)取1.0 g上述已脫膠的杜仲樹(shù)皮及葉的粉末和未脫膠的樹(shù)皮及葉的粉末,按照下述1.2.2方法進(jìn)行UMAE提取,得到黃酮提取液,根據(jù)1.2.3.2節(jié)中公式計(jì)算黃酮得率,從而比較杜仲膠的分離前后對(duì)杜仲樹(shù)皮及葉的黃酮提取率的影響。

1.2.1.2 杜仲膠分離時(shí)間的選擇 分別稱(chēng)取六份3.0 g的未脫膠的杜仲樹(shù)皮粉末,按照1.2.1.1設(shè)置超聲-微波萃取儀參數(shù),并分別設(shè)置時(shí)間為0、10、20、30、45和60 min,趁熱對(duì)提取液進(jìn)行減壓抽濾,對(duì)得到的脫膠杜仲樹(shù)皮粉末進(jìn)行干燥,備用。各稱(chēng)取1.0 g干燥后的經(jīng)不同分離時(shí)間脫膠的杜仲樹(shù)皮粉末,按照下述1.2.2方法進(jìn)行UMAE提取,得到黃酮提取液。根據(jù)1.2.3.2節(jié)中公式計(jì)算黃酮得率,從而確定最佳的杜仲膠分離時(shí)間。

1.2.2 杜仲黃酮的UMAE提取 各稱(chēng)取1.0 g上述已脫膠的杜仲樹(shù)皮及葉的粉末或未脫膠的樹(shù)皮及葉的粉末,與一定體積的不同濃度的乙醇溶液置于超聲-微波協(xié)同萃取儀的萃取瓶中進(jìn)行萃取,設(shè)定不同的液料比、提取溫度、微波功率、提取時(shí)間等條件進(jìn)行UMAE提取。隨后將提取液冷卻后離心(溫度4 ℃,轉(zhuǎn)速11000 r/min,時(shí)間10 min)。上清液經(jīng)過(guò)石油醚(沸程30～60 ℃)三次萃取去除脂溶性成分及葉綠素后,將所得的杜仲黃酮提取液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用提取時(shí)所使用的相應(yīng)濃度乙醇溶液定容至刻度,則為杜仲黃酮提取液。

1.2.2.1 杜仲黃酮的提取工藝優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn) 由于預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示杜仲葉中黃酮含量遠(yuǎn)高于樹(shù)皮,樹(shù)葉與樹(shù)皮相比更適合于作為提取黃酮類(lèi)化合物的原料,因此提取條件優(yōu)化時(shí)選用杜仲葉粉末進(jìn)行。由于儀器限定,超聲的功率(50 W/40 kHz)定額不可調(diào)節(jié),故本實(shí)驗(yàn)在該超聲功率下,考察其余因素的影響。稱(chēng)取1.0 g脫膠的杜仲葉粉末,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),得率為提取3次的平均值。首先,固定液料比40∶1 (mL∶g)、微波功率400 W、溫度70 ℃、提取時(shí)間10 min,考察不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%和80%)對(duì)杜仲黃酮得率的影響。其中,液料比為不同濃度的乙醇溶液的體積與杜仲葉粉末質(zhì)量的比值(mL∶g)。其次,固定乙醇濃度60%、微波功率400 W、溫度70 ℃、提取時(shí)間10 min,考察不同液料比[20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1 (mL∶g)]對(duì)黃酮得率的影響。再次,固定乙醇濃度60%、液料比60∶1 (mL∶g)、微波功率400 W、提取時(shí)間10 min,考察不同提取溫度(50、60、65、70、75和80 ℃)對(duì)黃酮得率的影響。最后,固定乙醇濃度60%、液料比60∶1 (mL∶g)、溫度70 ℃,考察不同微波功率(300、400、500和600 W)及不同提取時(shí)間(3、4、5、6、7和8 min)對(duì)黃酮得率的影響,從而確定最佳提取條件。

1.2.2.2 杜仲黃酮的提取工藝優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定杜仲提取時(shí)間為6 min,選取乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)和微波功率(D)四個(gè)顯著因素為自變量,以杜仲黃酮得率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用4因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)方法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面法因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.2.3 杜仲黃酮的測(cè)定

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 依據(jù)文獻(xiàn)方法[20]稍作改進(jìn),依次吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,分別加入到10 mL比色管中,于每個(gè)比色管中各加入5%的NaNO2溶液0.4 mL,渦旋混勻,靜置5 min,然后各加入10%的Al(NO3)3溶液0.4 mL,渦旋混勻,靜置6 min,再各加入4%的NaOH溶液4.0 mL,用30%的乙醇溶液定容至10.0 mL刻度線(xiàn),渦旋混勻,靜置10 min。依次于508 nm處測(cè)吸光度,參比為試劑空白,可得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c(mg/mL)與吸光度A的回歸方程為:A=11.351×c-0.0063,R2=0.9998。

1.2.3.2 杜仲黃酮含量的測(cè)定 將1.0 mL杜仲樹(shù)皮或杜仲葉黃酮提取液或稀釋液(可根據(jù)吸光度值適當(dāng)稀釋黃酮原液)置于10 mL比色管中,根據(jù)上述1.2.3.1方法[20],依次加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH相繼進(jìn)行反應(yīng),最后于508 nm處測(cè)吸光度,參比為試劑空白。根據(jù)1.2.3.1節(jié)中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程換算成樣品中的黃酮含量。

黃酮得率(%)=C×V×N×100/(M×1000)

其中:C為提取液中黃酮的含量(mg/mL);V為提取液體積(mL);N為稀釋倍數(shù);M為杜仲粉末質(zhì)量(g),1000為質(zhì)量單位換算系數(shù)。

1.2.5 超聲-微波(UMAE)與單獨(dú)超聲(UAE)、單獨(dú)微波(MAE)比較 分別稱(chēng)取三份質(zhì)量為1.0 g脫膠的杜仲葉粉末,按照表2設(shè)置提取條件進(jìn)行UMAE提取。根據(jù)1.2.3.2中公式計(jì)算黃酮得率。其中UAE提取法設(shè)定微波功率為100 W,僅起到加熱的作用[21],因?yàn)閮x器所限,若微波功率全關(guān)閉則達(dá)不到所設(shè)定的75 ℃提取溫度。

表2 超聲-微波、單獨(dú)超聲、單獨(dú)微波的黃酮提取條件Table 2 Setting conditions for UMAE,UAE and MAE

1.2.6 不同提取方法得到的黃酮清除DPPH自由基活性的比較 參照文獻(xiàn)的方法[22],測(cè)定了三種不同的提取方法(UMAE、UAE、MAE)所得到的黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率。具體操作如下,在具塞試管中加入濃度為1.0×10-4mol/L的DPPH溶液3.5 mL和無(wú)水乙醇0.5 mL,避光靜置30 min,測(cè)定其在517 nm下吸光度A1;在具塞試管中加入1.0×10-4mol/L的DPPH溶液3.5 mL和不同提取方法所得的杜仲葉黃酮提取液0.5 mL,避光靜置30 min,測(cè)定其在517 nm下吸光度A;在具塞試管中加入3.5 mL無(wú)水乙醇與0.5 mL樣品液,測(cè)定其吸光度A0。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。則樣品液對(duì)DPPH自由基的清除率為:

清除率(%)=[1-(A-A0)/A1]×100

1.2.7 提取完畢杜仲葉粉末殘?jiān)鼟呙桦婄R分析(SEM) 將UMAE、UAE、MAE提取后獲得的殘?jiān)酶稍锵渲?0 ℃干燥,取少量干燥后的三種杜仲葉粉末以及未經(jīng)黃酮提取的脫膠杜仲葉粉末作為對(duì)照,此四種杜仲葉粉末在離子濺射儀中完成真空鍍金后利用掃描電子顯微鏡進(jìn)行微觀分析。

1.2.8 HPLC法對(duì)杜仲樹(shù)皮及樹(shù)葉黃酮類(lèi)化合物的初步定性 參考方法[23],利用經(jīng)95%乙醇、5% HCl、5% NaOH依次浸泡預(yù)處理后的D101大孔樹(shù)脂對(duì)上述UMAE提取的杜仲樹(shù)皮和樹(shù)葉黃酮進(jìn)行純化。其中純化條件為:上樣液pH為4,上樣液和洗脫液流速為2 BV/h,洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。分別稱(chēng)取經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的杜仲樹(shù)皮及樹(shù)葉總黃酮凍干粉末,用色譜純甲醇溶解并配成1.0 mg/mL的樣品儲(chǔ)備液。另外,精確稱(chēng)取蘆丁、綠原酸、沒(méi)食子酸、槲皮苷、山奈酚、阿魏酸、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各0.0100 g,用50 mL甲醇溶解于50 mL 棕色容量瓶中,即得200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將樣品儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液過(guò)0.45 μm有機(jī)膜,進(jìn)HPLC分析。色譜條件:流動(dòng)相:甲醇(A)、超純水(B)和1%乙酸水溶液(C);流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;洗脫條件:0～45 min,20%～80% A,1%乙酸水溶液(C)始終保持10%;檢測(cè)波長(zhǎng):325 nm;柱溫:30 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)測(cè)定均重復(fù)3次,測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析,用Design Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 杜仲膠的分離

2.1.1 杜仲膠的分離對(duì)黃酮得率的影響 根據(jù)方法1.2.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn),圖1為杜仲膠的分離對(duì)杜仲黃酮得率的影響,由圖1可知,杜仲葉的黃酮得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于杜仲樹(shù)皮黃酮得率,但無(wú)論樹(shù)皮還是樹(shù)葉,杜仲膠分離后的黃酮得率都大于未脫膠的黃酮得率。樹(shù)皮中的杜仲膠含量大于樹(shù)葉中的膠含量[24],由1.2.1.1中杜仲膠計(jì)算公式可得本實(shí)驗(yàn)所得杜仲樹(shù)皮和樹(shù)葉含膠量分別為5.0%±0.2%和1.9%±0.1%。杜仲膠分離前后對(duì)樹(shù)皮黃酮得率的相對(duì)影響較大,黃酮得率相對(duì)提高50%左右(由0.5%升至1.0%),對(duì)樹(shù)葉黃酮得率相對(duì)影響較小(由12.2%升至12.6%)。

圖1 杜仲膠的分離對(duì)杜仲黃酮得率的影響Fig.1 Effects of gum separation on the extraction yield of flavonoids of E. ulmoides注：不同大、小寫(xiě)字母分別代表樹(shù)皮和樹(shù)葉脫膠前后的 黃酮得率的差異顯著(p<0.01)。

2.1.2 杜仲膠分離時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響 根據(jù)方法1.2.3.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得到杜仲膠的最佳分離時(shí)間,結(jié)果如圖2所示,分離時(shí)間在0～30 min范圍內(nèi),隨著分離時(shí)間的不斷增加,杜仲黃酮得率也隨之增高,但是當(dāng)分離時(shí)間超過(guò)30 min時(shí),杜仲黃酮得率基本保持不變,這是由于30 min可將杜仲膠分離完全,此時(shí)間后杜仲膠對(duì)黃酮的提取已不具影響,綜合能耗考慮,因此,杜仲膠的分離時(shí)間選取30 min左右為宜。

圖2 杜仲膠分離時(shí)間對(duì)杜仲樹(shù)皮黃酮得率的影響Fig.2 Effects of time of gum separation on the extraction yield of flavonoids of E. ulmoides

2.2 杜仲樹(shù)皮及樹(shù)葉黃酮類(lèi)化合物的成分比較

由于杜仲樹(shù)皮與樹(shù)葉的黃酮類(lèi)化合物得率差別甚大,圖1顯示脫膠后的樹(shù)皮及樹(shù)葉黃酮得率分別為1.0%和12.6%,為進(jìn)一步說(shuō)明杜仲樹(shù)皮與樹(shù)葉黃酮類(lèi)化合物的區(qū)別,本文采用HPLC法對(duì)杜仲樹(shù)皮及樹(shù)葉黃酮類(lèi)化合物的進(jìn)行初步定性。由圖3可知,通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間的比對(duì),相同濃度下的杜仲樹(shù)皮黃酮類(lèi)化合物含量低于樹(shù)葉提取物,尤其是蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚。樹(shù)葉同樣具有高于樹(shù)皮的酚酸類(lèi)化合物,如沒(méi)食子酸、綠原酸、阿魏酸等,此結(jié)果揭示了杜仲樹(shù)葉相比于樹(shù)皮可作為黃酮類(lèi)化合物及酚酸的較優(yōu)提取原料。Zhou[25]等人的研究結(jié)果類(lèi)似,杜仲樹(shù)皮及樹(shù)葉中的蘆丁、槲皮素、山奈酚含量分別為0.0169、0.0036、0.0021、0.0644、0.0302、0.0100 mg/g。今后可以通過(guò)HPLC-MS/MS以及核磁共振(NMR)對(duì)杜仲黃酮類(lèi)化合物進(jìn)一步準(zhǔn)確定性和定量。

2.3 杜仲黃酮提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

不同濃度乙醇溶液對(duì)杜仲黃酮得率的影響,結(jié)果如圖4(A)所示,乙醇濃度在40%～60%的范圍內(nèi),隨著乙醇濃度的不斷增加,杜仲黃酮得率也隨之增高,但是當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%時(shí),杜仲黃酮得率反而迅速下降。

圖4 單因素實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)杜仲葉黃酮得率的影響Fig.4 Effect of each factor on the extraction yield of the flavonoids from leaves of E. ulmoides by single factor experiment

圖4(B)為不同乙醇濃度時(shí)紫外波長(zhǎng)掃描圖,由于黃酮類(lèi)化合物的紫外光譜在220～400 nm通常有兩個(gè)吸收帶,處于300～400 nm的區(qū)域的吸收帶稱(chēng)帶I,220～280 nm為帶Ⅱ[26],此紫外波長(zhǎng)掃描圖符合黃酮特征光譜,且由圖4(B)可知,乙醇濃度為60%時(shí),相比其它濃度的吸光度高,黃酮提取最充分。這是由于當(dāng)乙醇濃度較低時(shí),主要是以水為提取溶劑,此時(shí)水溶性雜質(zhì)如一些多糖亦被溶解,使得黃酮得率并不高;隨著乙醇濃度的增加,溶液極性逐漸減小,弱極性的黃酮類(lèi)化合物在超聲波與微波共同作用下能充分溶解,使得黃酮得率升高[27-28]。當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大,水的比例降低,溶液極性變小,對(duì)微波能的吸收減弱,導(dǎo)致微波作用減弱,同時(shí)脂溶性成分如葉綠素會(huì)溶出,除此之外,高濃度的乙醇溶液亦會(huì)使植物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固,眾多因素都會(huì)使黃酮得率的降低[29-30]。綜上所述,乙醇濃度為60%時(shí)為最適應(yīng)的杜仲黃酮提取溶劑。

圖4(C)為不同液料比對(duì)杜仲黃酮得率的影響,液料比在20∶1～60∶1 (mL∶g)的范圍內(nèi)時(shí),杜仲的黃酮得率隨著乙醇比例的增加而增加,但是,當(dāng)液料比到達(dá)60∶1后,黃酮的得率卻基本保持不變。因?yàn)橐毫媳仍谔崛↑S酮類(lèi)化合物過(guò)程中主要影響著傳質(zhì)推動(dòng)力,即固體物料和提取溶劑之間的濃度差[30-31]。當(dāng)液料比增加時(shí),會(huì)提高傳質(zhì)推動(dòng)力,當(dāng)比例達(dá)到60∶1左右時(shí),黃酮得率已達(dá)到最大,說(shuō)明杜仲黃酮已被充分提取,繼續(xù)增大的溶劑體積會(huì)給萃取瓶?jī)?nèi)造成壓力,且增加能耗,杜仲黃酮提取的液料比為60∶1 (mL∶g)左右為宜。

圖4(D)為不同提取溫度對(duì)杜仲黃酮得率的影響,在50～80 ℃范圍內(nèi),隨著提取溫度的升高,黃酮得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),并在75 ℃時(shí)達(dá)到最高。這是由于在一定的溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,分子運(yùn)動(dòng)變得更加劇烈,黃酮在提取溶劑中的溶解度增大,但溫度過(guò)高可能會(huì)破壞黃酮的分子結(jié)構(gòu),同時(shí)一些非黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶解性也可能增大,且升高溫度亦可能凝固植物蛋白[30-31],導(dǎo)致黃酮溶出降低,從而降低黃酮得率,因此,杜仲黃酮的提取溫度以75 ℃為宜。

圖4(E)為不同微波功率在不同提取時(shí)間下對(duì)杜仲黃酮得率的影響,如圖4(E)可知,400 W微波功率提取6 min時(shí)黃酮得率最高。杜仲的提取時(shí)間會(huì)影響提取溶劑與細(xì)胞內(nèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)接觸的充分度,隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng),提取溶劑能夠更加充分的滲透到細(xì)胞內(nèi)部溶解黃酮。但是提取時(shí)間的繼續(xù)增加,則會(huì)因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溫度過(guò)高,破壞了黃酮提取物中的有效成分,同時(shí)高溫會(huì)凝固蛋白影響黃酮溶出。微波功率的增大會(huì)使原料吸收的微波能量增多,從而使黃酮更容易進(jìn)去溶劑中,但微波功率過(guò)高同樣會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)溫度過(guò)高,導(dǎo)致黃酮得率降低[30-31]。因此,提取時(shí)選擇微波功率400 W,提取時(shí)間6 min為宜。

通過(guò)SPSS法處理單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(表3),通過(guò)比較p值和F值的大小,我們可以確定影響杜仲黃酮得率的各因素大小關(guān)系為:乙醇濃度>微波功率>提取溫度>液料比>提取時(shí)間。其中,乙醇濃度、微波功率、提取溫度、液料比這四個(gè)因素顯著影響黃酮得率,而提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響不顯著。

表3 單因素實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results for single factor experiment

2.4 響應(yīng)面法對(duì)UMAE法提取杜仲黃酮的工藝優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化杜仲黃酮的提取 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)得出的顯著因素(乙醇濃度、微波功率、提取溫度、液料比),設(shè)定提取時(shí)間6 min,按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)原理,利用響應(yīng)面法,對(duì)杜仲黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 杜仲葉黃酮提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Response surface design and results for the extraction of the flavonoids from leaves of E. ulmoides

2.4.2 二次回歸方程擬合和方差分析 利用Design-Expert軟件,對(duì)表4中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,獲得以杜仲黃酮的得率Y為響應(yīng)值,對(duì)自變量乙醇濃度A、液料比B、提取溫度C和微波功率D四因素的回歸方程為:得率Y(%)=11.86-0.27A+0.22B-0.050C+0.35D-2.5×10-3AB-0.065AC-0.32AD-0.045BC-0.028BD+0.075CD-1.36A2-0.42B2-0.54C2-0.94D2,回歸模型的方差分析見(jiàn)表5。

表5 回歸方程的方差分析結(jié)果表Table 5 ANOVA results for the regression model

2.4.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面圖是響應(yīng)值即杜仲黃酮得率Y,對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素A、B、C、D所構(gòu)成的三維空間曲面圖形,從響應(yīng)面圖中,我們可以直觀地看出各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)黃酮得率的影響及兩兩因素之間的交互作用對(duì)黃酮得率的影響。根據(jù)所得回歸方程,以黃酮得率Y作為響應(yīng)值,乙醇濃度、液料比、提取溫度、微波功率四個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)于杜仲黃酮得率的三圍空間曲面圖見(jiàn)圖5。

如圖5(A)所示,相較而言,乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響比液料比顯著,在乙醇濃度與液料比的交互作用等高線(xiàn)中,乙醇濃度方向的等高線(xiàn)變化得更加密集。如圖5(B)所示,乙醇濃度相較提取溫度對(duì)杜仲黃酮的得率的影響更為顯著,在乙醇濃度與提取溫度的交互作用等高線(xiàn)中,乙醇濃度方向的等高線(xiàn)變化得更加密集。如圖5(C)所示,乙醇濃度相較微波功率對(duì)杜仲黃酮得率的變化較為顯著,在乙醇濃度和微波功率的交互作用等高線(xiàn)中,乙醇濃度等高線(xiàn)變化得更加密集。如圖5(D)所示,提取溫度相較液料比對(duì)黃酮得率的影響更顯著,在液料比和提取溫度的交互作用等高線(xiàn)中,提取溫

圖5 各因素交互作用對(duì)杜仲葉黃酮得率的響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface and contour plots for effects of interactions of various factors on the extraction yields of the flavonoids from leaves of E. ulmoides注:(A)乙醇濃度和液料比；(B)乙醇濃度和提取溫度；(C)乙醇濃度和微波功率;(D)液料比和提取溫度；(E)液料比和微波功率；(F)提取溫度和微波功率。

度的等高線(xiàn)變化得更加密集。如圖5(E)所示,微波功率相較液料比對(duì)黃酮得率的影響更顯著,在微波功率和液料比的交互作用等高線(xiàn)中,微波功率等高線(xiàn)變化得更密集。如圖5(F)所示,微波功率相較提取溫度對(duì)黃酮得率的影響更顯著,在微波功率和提取溫度的交互作用等高線(xiàn)中,微波功率等高線(xiàn)變化得更加密集。通常情況下,等高線(xiàn)的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,若為圓形則與之相反,而肉眼觀察不盡可靠,表5回歸方差分析的結(jié)果中F值和P值可更確切地說(shuō)明各因素交互作用顯著與否。由表5可知,乙醇濃度與提取溫度、乙醇濃度與微波功率、液料比與提取溫度、液料比與微波功率、提取溫度與微波功率之間交互作用顯著。

2.4.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)回歸模型預(yù)測(cè),杜仲黃酮最佳提取條件為:乙醇濃度57.54%,液料比70.13 (mL∶g),提取溫度74.82 ℃,微波功率420.27 W,預(yù)測(cè)得率為11.94%。考慮實(shí)驗(yàn)條件的可操作性,修正所得UMAE法提取杜仲葉黃酮的最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度58%,液料比70∶1 (mL∶g),提取溫度75 ℃,微波功率420 W。按照修正后的工藝條件進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得其得率為11.80%±0.09%,與預(yù)測(cè)值11.94%較為接近(相對(duì)誤差為1.17%),驗(yàn)證了模型可靠。

2.5 UMAE、UAE、MAE三種提取方法的比較

為了說(shuō)明超聲波及微波在協(xié)同提取中所產(chǎn)生的作用,本文以杜仲黃酮得率及杜仲黃酮得DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo),將UMAE、UAE、MAE提取方式進(jìn)行了比較,比較結(jié)果如圖6所示,可以看出采用UMAE提取較UAE與MAE提取方式黃酮得率上升明顯,UMAE提取方法所得的得率顯著高于UAE和MAE的得率(p<0. 001),且黃酮的抗氧化能力(以清除DPPH自由基能力為例)亦有類(lèi)似結(jié)果,UMAE提取法>UAE提取法>MAE提取法。由此可以得出,UMAE提取杜仲黃酮高效的原因是,超聲波及微波兩種方法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、相互協(xié)同,進(jìn)而提高得率。且本文所采取的協(xié)同方法提取杜仲黃酮,與前人利用超聲波輔助提取杜仲皮中的杜仲膠和杜仲黃酮相比,可顯著提高杜仲黃酮得率[19]。

圖6 超聲-微波協(xié)同、單獨(dú)超聲和單獨(dú)微波法 黃酮得率及DPPH自由基清除率的比較Fig.6 Comparison of the flavonoids from leaves of E. ulmoides by UMAE,UAE and MAE in terms of extraction yields and DPPH free radical scavenging ability

在比較黃酮得率及清除自由基能力的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步說(shuō)明協(xié)同提取高效作用的原因及機(jī)理,本文采用掃描電鏡(SEM)將不同提取方法提取前后的杜仲葉粉末進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)的觀察,其中提取前的杜仲葉粉末作為對(duì)照,提取后的粉末包括協(xié)同提取、單獨(dú)微波和單獨(dú)超聲輔助提取后所得粉末殘?jiān)?結(jié)果如圖7所示。由圖7可見(jiàn),相同的杜仲葉粉末分別經(jīng)過(guò)UMAE、UAE、MAE作用后,與未經(jīng)過(guò)提取的對(duì)照相比,組織結(jié)構(gòu)均遭到不同程度的破壞。對(duì)照?qǐng)D7(A)較為完整,樣品表面幾乎沒(méi)有孔洞。但是,經(jīng)過(guò)UMAE作用后的植物細(xì)胞無(wú)法識(shí)別(圖7(D)),相比圖7(B和C),其微觀結(jié)構(gòu)破壞程度最為嚴(yán)重,產(chǎn)生很多孔洞以利于黃酮類(lèi)化合物的快速溶出。這是由于細(xì)胞中的極性分子(H2O)作為吸能分子,以其高偶極矩劇烈吸收微波產(chǎn)生的熱量,利用微波能來(lái)高效加熱物料,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部急劇升溫和膨脹,從而導(dǎo)致細(xì)胞壁遭受?chē)?yán)重破壞,有效成分迅速溶出[31]。同時(shí),超聲波可通過(guò)機(jī)械粉碎及撞擊作用導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂,進(jìn)而產(chǎn)生空穴效應(yīng),產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波,最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物迅速通過(guò)破碎的細(xì)胞壁溶出[32],這同時(shí)也可以解釋為何圖7(C)單獨(dú)超聲法所形成的空穴比圖7(B)單獨(dú)微波法的空穴多。當(dāng)微波與超聲波同時(shí)協(xié)同作用時(shí),可產(chǎn)生一系列劇烈反應(yīng)使細(xì)胞內(nèi)的黃酮類(lèi)化合物更加迅速且充分地向外溶出。而單獨(dú)微波或者單獨(dú)超聲輔助僅能受到上述一種效應(yīng)的作用,無(wú)法同時(shí)接受超聲波、微波的共同效應(yīng),最終使得協(xié)同提取方法的黃酮得率及抗氧化能力顯著高于其他提取方法[12,33]。有研究表明,在比較超聲-微波協(xié)同和水浴振蕩提取牛蒡中多酚類(lèi)化合物含量時(shí),可從SEM電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)時(shí)得出相似結(jié)論[34]。

圖7 杜仲葉粉末殘?jiān)鼟呙桦婄R照片F(xiàn)ig.7 Scanning electron microscope pictures of residual powders of E. ulmoides leaves注:(A)對(duì)照；(B)；單獨(dú)微波；(C)單獨(dú)超聲;(D)超聲-微波協(xié)同提取;放大倍數(shù)均為2500倍。

3 結(jié)論

本文首先揭示了杜仲膠的分離對(duì)杜仲樹(shù)皮和樹(shù)葉黃酮提取的影響,且利用HPLC法比較了樹(shù)皮和樹(shù)葉的黃酮類(lèi)化合物的主要成分,樹(shù)葉中的黃酮類(lèi)化合物如蘆丁、槲皮素、山奈酚顯著高于樹(shù)皮中的含量,揭示了杜仲樹(shù)葉相比于樹(shù)皮可作為黃酮類(lèi)化合物的較優(yōu)提取原料。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上,利用響應(yīng)面法對(duì)杜仲黃酮的各個(gè)提取條件即乙醇濃度、提取溫度、微波功率和液料比進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后得到的杜仲黃酮最佳工藝條件為乙醇濃度為58%,液料比為70∶1 (mL∶g),溫度為75 ℃,微波功率為420 W,時(shí)間為6 min,此條件下的粗黃酮得率為11.80%±0.09%。UMAE提取方法與MAE或UAE提取法相比較,其黃酮得率顯著高于MAE和UAE(p<0.001),UMAE提取得到的杜仲黃酮清除DPPH自由基能力亦比較高。