樺褐孔菌黃酮類化合物的 提取工藝優化及抗氧化活性研究

張 靜,孫晶波,盛 瑜,安麗萍,杜培革,郭 笑

(北華大學藥學院,吉林吉林 132013)

樺褐孔菌[Inonotusobliquus(Pers.Fr.)Aoshi],又名白樺茸、黑樺菌、樺菌等,屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬[1-3],是生長在俄羅斯、中國吉林長白山以及日本北海道等寒冷地區白樺樹上的一種特殊真菌[4]。早在16世紀,樺褐孔菌就被東歐一些國家用來治療胃癌、心腦血管疾病以及糖尿病等[5]。大量研究發現,樺褐孔菌具有多種藥理學作用,包括抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌、降糖、保肝以及免疫調節等[6-10],其中以其抗腫瘤和抗氧化活性較為突出。

黃酮類化合物(flavonoids compounds)是自然界植物中分布最廣的一類天然產物,存在于植物體所有部分,常以游離態存在[11],對植物的生長、發育、開花、結果以及抵御異物侵入起重要作用[12]。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性,它在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、防治心腦血管疾病以及增強免疫力等方面都具有明顯作用[13-15]。此外,研究表明,黃酮類化合物還具有降壓、降血脂、保肝、解痙等生物活性[16-17],受到國內外學者的廣泛關注。然而目前,國內外對于樺褐孔菌黃酮類化合物的研究多集中在其多糖成分,而對樺褐孔菌黃酮的研究較少。

本文利用乙醇熱回流法[18]對樺褐孔菌黃酮類化合物進行提取,并對其抗氧化活性進行測定,相關結果為進一步研究樺褐孔菌黃酮及開發相應的抗氧化食品、藥品、保健品等提供理論基礎,也為促進我省樺褐孔菌相關產業的發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生樺褐孔菌 采摘于2015年10月,2016年3月合作單位胡慶余堂提供,經北華大學生藥學副教授李鳳麗鑒定為野生樺褐孔菌Inonotusobliquus(Pers.Fr.)Aoshi的子實體;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、醋酸、無水醋酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、過硫酸鉀 分析純,天津市永大試劑有限公司;蘆丁標準品(純度≥98%) 成都普菲德生物技術有限公司;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,純度≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,純度≥97.0%) 東京化工業株式會社MNEVG-T0;抗壞血酸(VC,純度≥99.7%) 天津市永大試劑有限公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,純度≥98%) 都萊生物技術有限公司R1707。

GZX-9140ME型數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;ATY224型電子天平 日本島津公司;HH·S 1-Ni型電熱恒溫水浴鍋北京長安科學儀器廠;RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司;infiniteM200型酶標儀 瑞士Tecan公司;ThermoMixer C型恒溫振蕩器 德國Eppendorf公司;FiveEasy plus 型pH儀 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 參照田春蓮等[19]的硝酸鋁顯色法對梯度濃度蘆丁標準品溶液,于510 nm處測吸光度值。以吸光度值(OD)為縱坐標,標準對照品濃度(g/mL)為橫坐標,繪制蘆丁標準曲線。

1.2.2 黃酮類化合物的提取 取適量樺褐孔菌于恒溫鼓風干燥箱105 ℃干燥至恒重。超微粉碎機粉碎,過60目篩。準確稱取樺褐孔菌粉末,以一定質量濃度的乙醇為提取劑一定溫度回流提取,上清液即為樺褐孔菌黃酮類化合物粗提液,收集上清液,重復2次,合并上清,70 ℃、55 r/min旋轉蒸發儀濃縮(V)。利用硝酸鋁顯色法[17-18]測定樺褐孔菌黃酮類化合物濃縮液中的黃酮含量,計算提取率,蘆丁標準品做對照。

式中:x為據蘆丁標準曲線所得測試樣樺褐孔菌黃酮類化合物濃度(g/mL);m為樺褐孔菌粉末質量(g);V為樺褐孔菌黃酮類化合物濃縮液體積(V)。

1.2.3 單因素實驗 采用1.2.2工藝提取樺褐孔菌黃酮類化合物,進行單因素實驗,考察各因素變量對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響。條件為:固定提取溫度80 ℃、提取時間1 h、乙醇濃度70%,重復2次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對黃酮提取率的影響;固定反應條件料液比1∶20 g/mL、提取時間1 h、乙醇濃度70%,重復2次,考察不同提取溫度(55、65、75、85、95 ℃)對黃酮提取率的影響;固定反應條件料液比1∶20 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間1 h,重復2次,考察不同乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)對黃酮提取率的影響;固定反應條件料液比1∶20 g/mL、提取溫度80 ℃、乙醇濃度70%,重復2次,考察不同提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交實驗據 根據單因素實驗結果,選取各因素影響黃酮類化合物提取率效果最明顯的因素,采用四水平三因素L9(34)的正交實驗設計,以確定樺褐孔菌黃酮類化合物提取的最優條件。

表1 正交因素水平設計Table 1 Orthogonal factor level design

1.2.5 抗氧化活性實驗 取一定量最佳工藝條件下制備的樺褐孔菌黃酮類化合物,進行抗氧化活性實驗。

1.2.5.1 總抗氧化能力的測定 將300 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH儀測定醋酸調pH至3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液與20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1比例混勻,制成FRAP工作液。吸取20 μL系列濃度為100、200、400、600、800、1000 μmol/L的FeSO4溶液于96孔酶標板中,再分別加入150 μL FRAP工作液,恒溫振蕩器混勻,37 ℃靜置10 min,于593 nm讀取吸光度值。以FRAP值(即FeSO4溶液的濃度(mol/L)為縱坐標,吸光度值(OD)為橫坐標繪制標準曲線[20-21]。

準確吸取VC和95%乙醇配制的樺褐孔菌黃酮類化合物溶液及其稀釋液各20 μL于96孔酶標板,各孔分別加入150 μL FRAP工作液,593 nm讀取吸光度值Ai。以用水代替FRAP工作液的反應液做空白(A0),VC做標準對照。由Ai- A0的差值在標準曲線上獲得其相應的FeSO4濃度(mol/L),即得樺褐孔菌黃酮類化合物的總抗氧化能力(FRAP)值。

1.2.5.2 DPPH·清除率的測定 用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液備用。用蒸餾水配制不同濃度(0.0050、0.0100、0.0200、0.0400、0.0800、0.1000 mg/mL)VC溶液和95%乙醇配制的不同濃度樺褐孔菌黃酮類化合物溶液適量。分別吸取100 μL VC溶液于96孔酶標板中,再分別加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液,恒溫振蕩器迅速混勻,室溫避光反應10 min,于517 nm讀取吸光度值。同時用蒸餾水或95%乙醇做空白。以對DPPH·清除率為縱坐標,溶液濃度(mg/mL)為橫坐標繪制清除率曲線[22-23]。用VC做標準對照。

式中,Ai:樣品溶液+DPPH溶液的吸光度值;Aj:樣品溶液+95%乙醇的吸光度值;A0:水/95%乙醇+DPPH溶液的吸光度值。

1.2.5.3 ABTS·清除率的測定 將100 mL 7 mmol/L ABTS和1.782 mL 140 mmol/L過硫酸鉀(使過硫酸鉀終濃度為2.45 mmol/L)混勻,室溫避光靜置過夜,使成ABTS·工作液。開始測量前用pH6.8的PBS緩沖液稀釋至A734=0.700±0.020。吸取40 μL系列濃度為0.0000、0.1000、0.2000、0.4000、0.6000、0.8000、1.0000 mg/mL的VC溶液和95%乙醇配制的黃酮類化合物樣品溶液于96孔酶標板中,再分別加入160 μL ABTS·工作液,混勻,25 ℃靜置4 min,于734 nm讀取吸光度值。不加樣品的反應液做空白;蒸餾水代替ABTS·工作液做對照。以清除率為縱坐標,濃度(mg/mL)為橫坐標繪制清除率曲線[24-25]。用VC做標準對照。

式中,Ai:VC溶液+ABTS·工作液的吸光度值;Aj:樣品溶液+蒸餾水的吸光度值;A0:水/95%乙醇+ABTS·工作液的吸光度值。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

由圖1得硝酸鋁顯色法線性回歸方程:y=0.01051x+0.00192,R2=0.99991。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同料液比提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結果如圖2所示,料液比為1∶10～1∶20 g/mL時,提取率隨提取溶劑用量的增大而增大,料液比為1∶20時提取率最高為6.11%,之后隨提取溶劑用量的增大,由于液體量增多,濃縮時間增長,損失量增多,導致樺褐孔菌黃酮類化合物提取率降低。

圖2 料液比對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.2 Effect ofsolid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.2 提取溫度對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同溫度提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結果如圖3所示,溫度為55～75 ℃時,提取率隨提取溫度的升高而增大,溫度為75 ℃時提取率最高為9.33%,之后隨提取溫度的升高,黃酮被破壞和降解,其他可溶性雜質析出,影響黃酮的溶解,致樺褐孔菌黃酮類化合物提取率降低。

圖3 提取溫度對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.3 Effect of extractiontemperature on the extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.3 乙醇濃度對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同乙醇濃度提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結果如圖4所示,乙醇濃度為50%～60%時,提取率隨乙醇濃度的升高而增大,乙醇濃度為60%時提取率最高,為7.29%,之后隨乙醇濃度的升高,黃酮溶解率降低,導致樺褐孔菌黃酮類化合物提取率降低。

圖4 乙醇濃度對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.4 提取時間對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同時間提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結果如圖5所示,提取時間為0.5～2.0 h時,提取率隨時間的增大而增大,提取時間為2.0 h時提取率最高為10.65%,之后隨時間的增大,致已經溶解的黃酮被藥渣反吸,使樺褐孔菌黃酮類化合物提取率逐漸降低。

圖5 提取時間對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.5 Effect of extractiotime on extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.3 正交實驗

由表2方差結果可知,各因素對樺褐孔菌黃酮類化合物提取率影響的大小順序為C>B>D>A,即提取溫度>乙醇濃度>提取時間>料液比。由K值可知,優化工藝組合為A3B2C2D2,而正交實驗提取率最高組合為A1B2C2D2,故將兩組分別進行驗證實驗。其中A3B2C2D2組合的平均提取率為10.66%±0.17%,A1B2C2D2組合的平均提取率為10.62%±0.33%,證明樺褐孔菌黃酮類化合物提取率最優條件為正交實驗優化工藝組合A3B2C2D2,即料液比1∶25 g/mL,乙醇濃度60%,提取溫度75 ℃,提取時間2.0 h。

表2 樺褐孔菌黃酮類化合物熱回流法正交實驗Table 2 Orthogonal experiment of hot reflux method of flavonoids from Inonotus obliquus

2.4 抗氧化活性實驗

2.4.1 總抗氧化能力的測定 由圖6得線性回歸方程:y=850.28176x-2.35817,R2=0.99996。由圖7得線性回歸方程:y=0.01171x-0.00112,R2=0.99994。經計算,200 μg/mL時,VC的吸光度(OD)為2.34,樺褐孔菌黃酮類化合物的OD值為0.55,兩者的FRAP值分別為1988.05、464.53 μmol/L,即樺褐孔菌黃酮類化合物還原能力相當于VC的0.23倍。

圖6 FeSO4的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of FeSO4

圖7 VC的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of VC

2.4.2 DPPH·清除率的測定 由圖8可知,VC和樺褐孔菌黃酮類化合物對DPPH· 的清除能力均隨著樣品質量濃度的增大而增大,其EC50分別為28.95和36.44 μg/mL。樺褐孔菌黃酮類化合物對DPPH·清除能力略弱于VC,但二者對DPPH·的清除能力均能達到80%以上。EC50越小,抗氧化能力最強。說明樺褐孔菌黃酮類化合物對DPPH·存在良好的清除能力。

圖8 VC和樺褐孔菌黃酮類物質對DPPH·清除率的影響Fig.8 Effects of VC and flavonoids from Inonotus obliquus on DPPH free radicals clearance

2.4.3 ABTS·清除率的測定 由圖9可知,VC和樺褐孔菌黃酮類化合物對 ABTS·的清除能力均隨著樣品質量濃度的增大而增大,其EC50分別為235.68和299.89 μg/mL。樺褐孔菌黃酮類化合物對ABTS·清除能力略弱于VC,但二者對ABTS·的清除能力均能達到90%以上。說明樺褐孔菌黃酮類化合物對ABTS·存在良好的清除能力。

圖9 VC和樺褐孔菌黃酮類物質對ABTS·清除率的影響Fig.9 Effects of VC and flavonoids from Inonotus obliquus on ABTS free radicals clearance

3 結論

該研究利用乙醇熱回流法對野生樺褐孔菌進行提取。在溫度75 ℃,乙醇濃度60%,提取時間2.0 h,料液比1∶25 g/mL條件下提取黃酮類化合物含量最高為53.25 mg/mL,提取率為10.66%±0.17%,對樺褐孔菌黃酮類化合物的抗氧化能力進行測定發現其具有較強的抗氧化能力:其FRAP值相當于VC的0.23倍;對DPPH·清除率達80%以上;對ABTS·清除率達90%以上。

綜上所述,樺褐孔菌中黃酮類化合物含量豐富,且有較強的抗氧化活性,有望作為天然抗氧化劑被廣泛應用,本研究為樺褐孔菌黃酮的開發及應用奠定了良好的理論基礎。