響應面法優化咖啡葉中 芒果苷提取工藝的研究

黃麗卿

(1.漳州職業技術學院,福建漳州 363000;2.農產品深加工及安全福建省高校應用技術工程中心,福建漳州 363000)

芒果苷具有抗糖尿病及其并發癥、抗腫瘤、抗高尿酸血癥、調節脂代謝異常、保護心血管和神經、保護肝臟、促進骨骼發育、抗過敏和調節免疫力等廣泛的藥理作用[1]。

芒果苷不僅存在于芒果樹葉片中及其枝條中[2-3],還存在于其它的植物中,如周榮光等[4]報道了芒果苷存在于漆樹科扁桃葉中,李開通等[5]通過高效液相色譜(HPLC)法測定不同產地和品種石韋中芒果苷的含量,帥歐等[6]報道了從瑞香科沉香葉中提取芒果苷的工藝,袁葉飛等[7]也研究了川西獐牙菜中芒果苷的提取分離,楊瀟等[8]報道了利用超聲波提取百合科知母中的芒果苷。

盡管上述文獻均提到了以上各植物中芒果苷的提取方法,但值得指出的是,由于咖啡樹在我國的云南、海南、廣西、廣東、福建均有種植[9-10],它作為一種已規模化種植的作物,不僅可以收獲高價值的咖啡豆,還可以制作咖啡葉茶[11],與此同時,從本研究的分析發現咖啡葉子中含有豐富的芒果苷(mangiferin),可以用于提取功能成分。由于咖啡葉中芒果苷的提取方法尚未見報道,本研究利用響應面法優化咖啡葉中芒果苷的提取工藝,以期為咖啡葉功能成分分析和深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡葉 “阿拉比卡”品種,采摘于福建省漳州天綠咖啡(南坑)示范基地,選用咖啡樹上墨綠色的葉子,采摘后8 ℃冷藏保存;芒果苷標準品(HPLC≥98%) 上海純優生物科技有限公司;水 高純水,實驗室自制;甲醇 國產色譜純;磷酸 國產分析純。

Waters2998高效液相色譜儀 美國Waters公司;ZB-5斬拌機 華映食品機械有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 金壇市新航儀器廠;AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 咖啡葉中芒果苷的提取工藝 工藝流程:咖啡葉→斬拌機快速斬拌→提取→過濾→測量濾液體積→HPLC法測定濾液中芒果苷的含量。

操作要點:取新鮮的咖啡葉,置于斬拌機內快速斬拌,斬拌成約0.2 cm×40 cm大小的葉片備用。準確稱取斬拌后的咖啡葉10 g,置于具塞的三角瓶中,加入乙醇溶液,在恒溫水浴鍋中加熱提取,用300目濾布過濾,測量濾液體積,最后采用HPLC法測定濾液中芒果苷的含量。

1.2.2 芒果苷含量測定

1.2.2.1 芒果苷高效液相色譜的測定條件 色譜柱:Dimaonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長240 nm,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,進樣量10 μL,以甲醇-0.2%磷酸水溶液(30∶70)為流動相等度洗脫25 min[12]。

1.2.2.2 芒果苷標準曲線的建立 稱取芒果苷對照品分別配制0.049、0.098、0.147、0.196、0.245、0.294、0.343 mg/mL的標準溶液,按照1.2.2.1方法操作,以峰面積(A)為縱坐標,進樣溶液中芒果苷含量(C,mg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線。標準曲線方程為A=21676882C+397632(相關系數r=0.9992),結果表明,芒果苷進樣量在0.049～0.343 mg/mL范圍內,峰面積與溶液中芒果苷含量呈良好線性關系。

式中:C:濾液中芒果苷含量(mg/mL);V:濾液體積(mL);m:咖啡葉的質量(mg),本實驗咖啡葉用量為10 g,即為m=10000 mg。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料液比 在提取溫度65 ℃,提取時間60 min和乙醇濃度60%的條件下,考察不同的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL對咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.4.2 乙醇濃度 在提取溫度65 ℃,提取時間60 min和料液比1∶15 g/mL的條件下,考察不同的乙醇濃度55%、60%、65%、70%、75%對咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.4.3 提取溫度 在乙醇濃度70%,料液比1∶15 g/mL和提取時間60 min條件下,考察不同的提取溫度50、55、60、65、70 ℃對咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.4.4 提取時間 在乙醇濃度70%,料液比1∶15 g/mL和提取溫度55 ℃條件下,考察不同提取時間40、50、60、70、80 min對咖啡葉中芒果苷提取率的影響。

1.2.5 響應面實驗設計 以單因素實驗結果為依據,采用Box-Behnken實驗設計及響應面法分析,探索咖啡葉中芒果苷提取的最佳工藝參數[13-14]。以芒果苷提取率為響應值,具體實驗設計的因素和水平見表1。

表1 實驗設計的因素和水平Table 1 factors and levels of experiment design

1.3 數據處理

采用Origin 8.5軟件繪制單因素影響芒果苷提取率的趨勢圖,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計與分析。

2 結果與分析

2.1 芒果苷對照品和測試品色譜圖

芒果苷對照品和測試品色譜圖如圖1所示。

圖1 對照品(A)與測試品(B)色譜圖Fig.1 chromatography of the standard substance A and the test products B

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對芒果苷提取率的影響 由圖2可知,隨著乙醇溶液用量增加,芒果苷提取率也隨著迅速提升,當料液比達到1∶15 g/mL時,提取率為0.275%。隨著乙醇溶液用量繼續增加,芒果苷提取率小幅上升,變化不大。當咖啡葉與乙醇溶液充分接觸后,再增加溶劑用量對芒果苷提取率的影響不顯著(p>0.05),從提高提取率和降低成本兩方面綜合考慮,料液比1∶15 g/mL較合適。

圖2 料液比對芒果苷提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of mangiferin

2.2.2 乙醇濃度對芒果苷提取率的影響 由圖3可知,芒果苷的提取率隨乙醇濃度的增加而升高,乙醇濃度為70%時,芒果苷的提取率達到峰值,為0.311%。此后,隨著乙醇濃度的增加,芒果苷的提取率降低。有學者指出芒果苷易溶于熱的稀乙醇溶液,而當乙醇濃度太高時反而降低其溶解度[6]。因此,乙醇濃度選擇70%為宜。

圖3 乙醇濃度對芒果苷提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of mangiferin

2.2.3 提取溫度對芒果苷提取率的影響 由圖4可知,芒果苷的提取率隨提取溫度的上升而升高,加熱溫度為55 ℃時,芒果苷的提取率達到峰值,為0.374%。此后,隨著溫度升高,芒果苷的提取率反而降低。提取溫度升高,芒果苷擴散速度加快,溶出增多,提取率升高,但是咖啡葉中成分較為復雜,此外葉片類含有一定量的Mg2+、Ca2+、Cu2+等金屬離子,有文獻指出芒果苷屬于黃酮類化合物,長時間的高溫加熱容易與溶液中的金屬離子形成化合物從而誘導芒果苷的氧化,使芒果苷提取率下降[15]。因此,提取溫度選擇55 ℃比較合適。

圖4 提取溫度對芒果苷提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of mangiferin

2.2.4 提取時間對芒果苷提取率的影響 由圖5可知,芒果苷的提取率隨提取時間的延長而快速增加,提取時間為70 min時,芒果苷的提取率達到峰值,為0.428%。此后,隨著提取時間延長,芒果苷的提取率平緩下降。原因可能是長時間的浸提使芒果苷易被共存的酶分解而導致提取率降低[16]。因此,提取時間選擇70 min為宜。

圖5 提取時間對芒果苷提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of mangiferin

2.3 響應面法優化咖啡葉中芒果苷的提取工藝

表2 實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

為檢驗方程有效性,利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中實驗結果進一步分析,多元回歸模型的方差分析及顯著性結果見表3。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model

2.3.2 響應面分析與優化 利用Design-Expert 8.0.6軟件,繪制乙醇濃度、提取溫度和提取時間中任何兩因素的交互作用對咖啡葉中芒果苷提取率影響的響應面圖和等高線圖[14],結果如圖3所示。

從圖6(a、b)可以明顯看出,在提取時間為75.76 min的條件下,隨著提取溫度和乙醇濃度增加,咖啡葉中芒果苷提取率先升高后降低,最高值出現在響應面圖6(b)的穹頂位置,在乙醇濃度69%～72%、提取溫度55～57 ℃的范圍內。

從圖6(c、d)可以看出,在提取溫度為55.95 ℃的條件下,隨著乙醇濃度和提取時間的增加,咖啡葉中芒果苷提取率先升高后降低,最高值出現在響應面圖6(d)的穹頂位置,在乙醇濃度68%～72%、提取時間73～78 min的范圍內。

從圖6(e、f)可以看出,在乙醇濃度為70.15%的條件下,隨著提取溫度的升高,咖啡葉中芒果苷提取率先升高后降低,但是,提取時間長短對提取率的影響有限。芒果苷提取率的最高值出現在溫度55～57 ℃、提取時間73～78 min的范圍內。

圖6 等高線(a、c、e)及響應面(b、d、f)Fig.6 Contour plot(ace)and response surface(bdf)

2.3.3 最佳提取工藝參數的預測 通過實驗模型分析,得出咖啡葉中芒果苷最佳提取工藝為乙醇濃度70.15%,提取溫度55.95 ℃,提取時間75.76 min,在預測的最佳工藝條件下,咖啡葉中芒果苷的提取率為0.438%。盡管該數值低于表2中的第14組數據0.4417%,但是由于第14組數據的工藝條件在表2實驗中一共重復出現了5次,取其平均值得0.430%,低于預測值,故取預測值的工藝條件作為最優條件。

2.3.4 模型的驗證 為便于實際操作,模型驗證時工藝條件采用乙醇濃度70%,提取溫度56 ℃,提取時間76 min,進行3次平行實驗,實驗結果是芒果苷提取率的平均值為0.432%,變異系數為 1.39%,實際測定值與理論值(0.438%)相對誤差<0.05,說明響應面設計的結果可靠合理。

3 討論

從植物中提取芒果苷,楊瀟[8]等采用超聲波輔助提取法從知母中提取芒果苷,提取率可達1.85%;帥歐[6]等以沉香葉為原料,采用回流提取,芒果苷得率達3.31%;鄧家剛[3]采用超聲波輔助提取法從芒果葉中提取芒果苷,廣西不同品種芒果葉和枝條中芒果苷提取率1.51%～8.71%。李開通[6]等采用超聲波輔助提取法從石韋中提取芒果苷,產地湖南的光石韋藥材芒果苷提取率最高,達3.759%,而有柄石韋和石韋不含芒果苷或含量極低。以上研究所用的原料均為干品,本研究所用原料是新鮮的咖啡葉,水份含量經測定為75.3%,芒果苷的提取率是0.432%,折算成干品,芒果苷的提取率約為1.75%,因此,咖咖葉中芒果苷的含量是相當豐富的。考慮到后續工業化生產的需要,本研究采用醇提方法,可為咖啡葉中芒果苷的進一步開發研究提供了理論依據。但不同產地、品種及不同成熟度的咖啡葉的芒果苷含量不同及不同提取方法對芒果苷提取率的影響等方面有待進一步的研究。

4 結論

針對咖啡葉資源,以確定咖啡葉中芒果苷的最佳提取工藝為目的,在單因素實驗的基礎上,利用響應面分析法優化提取工藝。確定最佳提取工藝為:料液比1∶15 g/mL、乙醇濃度70%、提取溫度56 ℃、提取時間76 min,在此條件下,咖啡葉中芒果苷的提取率為0.432%。