嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的檢測

尹麗麗,薛 霞,周禹君,鄭 紅,王 駿,祝建華,劉艷明

(山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南 250101)

維生素K1又名葉綠基甲萘醌,是促進血液正常凝固及骨骼生長的重要維生素。維生素K是肝內合成凝血酶原的必需物質,維生素K缺乏時,可導致凝血機制障礙[1]。經常流鼻血者、近期有嚴重灼傷或外傷者、正服用抗生素者和早產嬰兒等都容易發生維生素K缺乏癥。在臨床上,已將維生素K1用于獲得性維生素K依賴性凝血因子缺乏癥[2]、新生兒自然出血癥[3-4]等維生素K缺乏癥的防治。研究表明,在嬰幼兒配方乳粉中添加一定量的維生素K1,對于維生素K缺乏癥有很好的預防作用。

維生素K1是一種脂溶性維生素,屬于多環芳香酮,對熱、氧、及水分作用穩定,但在堿性環境下,受陽光照射會分解。

對于維生素K1的檢測方法主要有毛細管電泳法[5],分光光度法[6],液相色譜-紫外檢測器法[7-11],液相色譜-柱后衍生法[12-14]。其中毛細管電泳法和分光光度法檢測步驟繁瑣,且精密度不高;高效液相色譜紫外檢測器法的靈敏度低;而文獻[12-14]中使用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測器時,由于流動相中使用的二氯甲烷對反相色譜系統的脫氣包具有強烈的腐蝕作用,對儀器損害較大;此外,國家標準[15]中使用的四氫呋喃對人體危害較大。目前,國家標準[15]中,嬰幼兒配方乳粉中維生素K1檢測的前處理過程是:用脂肪酶酶解,經堿皂化后,用有機溶劑提取。在此過程中,由于維生素K1在堿性環境中不穩定等原因,往往會導致目標物回收率低,檢測結果精密度差。

本文采用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測法對嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的檢測進行了系統性的研究。通過優化流動相條件,減少了對反相色譜系統的儀器損害,提高了方法的靈敏度和選擇性;針對方法中的關鍵步驟-酶解、皂化和萃取進行了分析、總結和優化,使維生素K1的檢測方法更加穩定可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素K1標準品 Dr.Ehrenstorfer公司;脂肪酶(酶活力≥700 U/mg) sigma公司;甲醇(色譜純) 美國Fisher公司;symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國Waters公司;鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm) 上海安譜實驗科技股份有限公司;正己烷(色譜純) 美國默克公司;酚酞(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈉(分析純) 西隴化工股份有限公司;碳酸鉀(優級純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;氯化鋅(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;乙酸鈉(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;嬰幼兒配方乳粉 超市購買某知名品牌。

Waters 2695高效液相色譜儀(配熒光檢測器) 美國Waters公司;AB204-S型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;SB-800DTD型超聲波清洗器 中國寧波新芝生物科技股份有限公司;3-18K型冷凍離心機 德國Sigma公司;mini-Q超純水制備器 美國MILLIPORE公司;HGC-24型氮吹儀 中國HENGAO公司;恒溫水浴振蕩器 德國優博萊公司;渦旋混合器 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

1.2.1.1 標準品溶液的校正 稱取維生素K1標準品20.0 mg于10.00 mL容量瓶中,用正己烷溶解并定容,配制成維生素K1母液。取200 μL維生素K1母液至25 mL容量瓶中,用正己烷定容,配制成濃度約為16 μg/mL的校正溶液,用紫外可見分光光度計在248 nm條件下校正(校正方法見[15])。

1.2.1.2 標準工作液的配制 精確移取經校正過的維生素K1儲備液,氮氣吹干后,用甲醇溶解,配制成濃度為:0.2,0.5,1,2,5 μg/mL的標準工作液。

1.2.2 樣品處理過程 準確稱取乳粉試樣2.5 g(精確到0.01 g),于50 mL離心管中,加入一定量的脂肪酶后,加入10 mL(37±2) ℃溫水溶解,渦旋2～3 min后,置于(37±2) ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩一定時間,使其充分酶解。取出酶解好的試樣,加入10 mL無水乙醇,加入一定量的堿,充分混合均勻,進行皂化反應。加入15 mL正己烷,渦旋5 min,進行萃取。5000 r/min離心3 min,取上清液至50 mL離心管,加入10 mL飽和氯化鈉溶液和兩滴0.5%酚酞乙醇溶液,渦旋5 min,進行水洗。6000 r/min離心3 min,取上清液至50 mL離心管中,氮氣吹干,準確加入2.00 mL甲醇復溶,過有機濾膜后,高效液相色譜儀進行測定。

1.2.3 高效液相色譜條件 symmetry C18色譜柱:250 mm×4.6 mm,5 μm;鋅還原柱:50 mm×4.6 mm;流速:1 mL/min;檢測波長:激發波長為243 nm,發射波長為430 nm;進樣量:10 μL;流動相:甲醇(含有冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無水乙酸鈉0.5 g/L)。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 線性范圍與檢出限 將1.2.1.2配制的系列標準工作溶液進行液相色譜條件下測定,以維生素K1峰面積為縱坐標,以標準工作溶液的濃度為橫坐標,進行標準曲線的繪制。加標空白樣品基質按照1.2.2樣品前處理過程,在1.2.3液相色譜條件下進行測定,通過目標物的響應與背景噪音的比值計算維生素K1的方法檢出限。

1.2.4.2 精密度實驗 對32、72、115μg/100 g三個不同含量的樣品分別進行6次獨立測定,計算精密度。

1.2.4.3 回收率實驗 根據GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢驗》的要求,結合實際檢測樣品中維生素K1的含量,對空白樣品進行5、10、100 μg/100 g三個水平的加標測定,計算加標樣品測定值與樣品測定值之差,通過其差值與實際添加的目標物含量之間的比值計算回收率。

1.3 數據處理

通過與儀器配套的Empower 3工作站軟件完成數據采集與處理。

2 結果與分析

本文對國家標準[15]中的關鍵技術-酶解條件、皂化條件和萃取條件和流動相條件進行研究,經過優化并改進,維生素K1的檢測方法更加穩定、可靠。

2.1 酶解條件的選擇

前處理過程中,首先用脂肪酶降解試樣中的不飽和脂肪酸,在酶解過程中,酶的用量對目標物的提取有一定影響,本文比較了酶解時間和脂肪酶用量不同時,目標物的回收率與精密度。由表1可知,酶解6 h和12 h(脂肪酶量為0.8 g條件下),對于目標物含量的測定,效果相當,但是由于前處理操作復雜,包括酶解、皂化、萃取、水洗等步驟,如果樣品量少,可選擇當天酶解6 h,如果樣品量多,當天酶解時間緊迫,建議選擇酶解過夜12 h;另一方面,不同脂肪酶量在酶解12 h的條件下,回收率無明顯差異,但是酶量越小(即0.2 g和0.4 g酶量)時,后續的萃取步驟中液液兩相分層越不明顯,結果的精密度越差,當酶量較大(即0.8 g脂肪酶),后續的萃取步驟中液液兩相分層明顯,結果精密度好,故采用0.8 g脂肪酶酶解12 h的酶解條件。

表1 酶解條件的比較Table 1 Comparison of enzyme solution conditions

2.2 皂化條件的選擇

皂化反應中,堿的作用是使酶解后的脂肪生成脂肪酸鹽,溶解于水相中,加入量的多少會直接影響回收率。加入量過少會使皂化反應不完全,萃取時不容易分層;過多則會和目標物維生素K1反應,使最后的結果偏低;乙醇的作用是保護維生素K1不參與反應,同時起到消泡促進分層的作用。本文對皂化條件中堿的種類及用量進行了考察,具體結果見表2。由表2可知,皂化用堿若選擇NaOH溶液(10 moL/L,2 mL)回收率低,精密度差,若選擇NaOH溶液(10 moL/L,0.5 mL)時,精密度差。原因可能是由于兩種NaOH溶液堿性太高,目標物與堿反應而被分解,故在此條件下不穩定存在;本文在皂化反應中使用K2CO3固體,堿性相對低,目標物在此條件下穩定存在,因此具有較高的回收率和精密度。

表2 皂化條件的比較Table 2 Comparison of saponification conditions

2.3 萃取條件和水洗條件的比較

萃取是為把目標物維生素K1從皂化后溶液中萃取出來,也是進一步凈化的過程。維生素K1是脂溶性維生素,故采用有機溶劑正己烷作為萃取溶劑。文章對于萃取次數進行了考察,發現萃取兩次和萃取一次的測定結果基本一致,因此,從提高前處理效率的角度,建議萃取一次。

由于維生素K1對堿液不穩定,所以需要用水把萃取溶劑正己烷中可能攜帶的堿液洗掉。另外,水洗時加入飽和氯化鈉,可防止液液分配過程的乳化。從表3中可以看出,增加水洗步驟,可明顯提高目標物含量隨時間變化的穩定性,但是水洗2次,目標物含量損失變大,因此,建議水洗一次。

表3 水洗對目標物含量穩定性考察Table 3 The stability of target content by washing

為了使有機相和水相分層明顯,保證實驗可重復性,水洗過程中需加入兩滴酚酞溶液(0.5%)。加入酚酞是否影響目標物含量的測定結果見表4。從表4中可以看出,加入酚酞不影響對目標物含量的測定。

表4 酚酞對目標物的影響Table 4 The effect of phenolphthalein on target objects

2.4 流動相條件的比較

目前,高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測的檢測方法中通常流動相含有四氫呋喃或二氯甲烷。國家標準[15]中流動相使用的四氫呋喃,四氫呋喃對身體危害較大;文獻中[12-14]使用的流動相含有二氯甲烷,二氯甲烷對反相色譜系統的脫氣包具有強烈的腐蝕性,長期大量使用會造成脫氣包滲漏。本文比較了流動相中是否含有二氯甲烷對目標物分離效果的影響,具體譜圖見圖1～圖4。圖1和圖2為使用流動相A(甲醇中含有冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無水乙酸鈉0.5 g/L)條件下采集的色譜圖。圖3和圖4為使用流動相B(甲醇中含有二氯甲烷10%,冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無水乙酸鈉0.5 g/L)條件下采集的色譜圖。通過比較圖2和圖4發現,使用流動相A(不含二氯甲烷溶液)進行色譜分析,峰型理想,分離效果相對更好。流動相中不含有二氯甲烷,減少了對儀器反相系統的損害,也減少了對身體的危害,故本文使用流動相條件A。

圖1 使用流動相A條件下采集的標準品色譜圖Fig.1 The chromatogram of standard solution by using phase A

圖2 使用流動相A條件下采集的樣品的色譜圖Fig.2 The chromatogram of samples by using phase A

圖3 使用流動相B條件下采集的標準品的色譜圖Fig.3 The chromatogram of standard solution by using phase B

圖4 使用流動相B條件下采集的樣品的色譜圖Fig.4 The chromatogram of samples by using phase B

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍與檢出限 標準工作溶液線性回歸方程為:Y=2.1E+6X-69808,線性相關系數R2=0.9995。本文采用加標空白樣品基質中標樣對應的響應與背景噪音的比值(S/N=3計算得到維生素 K1的方法檢出限為1 μg/100 g。

2.5.2 精密度實驗 由表5可見,三個樣品的精密度均小于5%,實驗數據穩定,精密度較高。

表5 精密度實驗結果Table 5 Results of precision experiment

2.5.3 回收率實驗 由表6可知,空白樣品進行三個水平的加標測定,回收率在90%～110%之間。本方法對乳粉質控樣品NIST SRM 1849a樣品進行檢測,測定結果為0.97 mg/kg,在標定值(1.06±0.17 mg/kg)的偏差范圍內。

表6 回收率實驗結果Table 6 Results of recovery

3 結論

上述實驗表明,影響乳粉中維生素K1測定的關鍵因素有:酶解條件、皂化條件、萃取條件和流動相條件。本文通過對關鍵因素的考察,確定了以下實驗條件,包括酶解條件:酶解量0.8 g,酶解時間12 h;皂化條件:碳酸鉀1.0 g;萃取條件:正己烷萃取一次,飽和氯化鈉水洗一次;流動相條件:甲醇(含有冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無水乙酸鈉0.5 g/L)。

綜上所述,本文通過對方法中關鍵技術條件的優化,使維生素K1的檢測方法操作簡單、高效、準確度高,同時減少了對液相色譜儀-反相系統的損傷,降低了對檢驗人員身體的危害。本方法不僅可以為生產企業控制維生素K1的添加量、準確標示給予指導,還可以為科研機構積累、總結維生素K1含量范圍及趨勢提供技術支持。