采用電子鼻和GC-MS技術 研究慕薩萊思中揮發性成分

張 璐,張 昱,黃 英,軒 燕,侯旭杰,*

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

“慕薩萊思”是新疆阿瓦提縣流傳千年極富民族特色的特有飲品,是當地少數民族釀造的一種葡萄酒類的天然果汁,被視作古代西域葡萄酒的“活化石”[1],是古代絲綢之路商賈與刀郎部落友好交往的文化產物。與現代工藝釀造的葡萄酒不同,慕薩萊思酒體的顏色略微暗淡混濁,口感質樸醇厚,具有令人愉悅的芳香氣味[2]。它是將和田紅等葡萄,經過壓榨取汁,熬煮濃縮之后,通過自然發酵釀制而成的具有獨特風格的葡萄酒。根據當地人的個人口味以及需求不同,在釀造過程中可以適當加入一些鹿茸、紅棗、枸杞、藏紅花、大蕓等中藥材,因而含有眾多對人體有益的維生素、氨基酸以及多酚類化合物等,其營養豐富,具有一定的養生功效,是保健品中的極品[3-5]。

為充分利用我區的葡萄品種資源并提高慕薩萊思產品的附加值和市場競爭力,對酒中風味物質的研究尤為重要。目前慕薩萊思香氣成分研究還處于起步階段,張雅茹等[6]初步確定了慕薩萊思中的數種香氣成分。在此基礎上對典型慕薩萊思呈香物質進行檢測,獲得其典型性香氣物質。電子鼻[7-8]作為新興鑒別檢測手段,能夠利用數據建立模型進行定性定量研究,可以為今后對慕薩萊思酒的區分鑒別提供參考基礎。

本研究以新疆阿瓦提刀郎慕薩萊思公司的慕薩萊思為樣品。利用固相微萃取(SPME)和氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)以及智能感官電子鼻,對慕薩萊思酒樣的呈香物質進行萃取、檢測以及特征分析。篩選出慕薩萊思中主要的特征香氣成分,獲得其典型性香氣物質,彌補單一分析方法的不全面性,分別從宏觀和微觀上對慕薩萊思呈香物質的差異進行相互驗證,建立快速檢測辨別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

慕薩萊思不同酒精度原酒(8%vol、10%vol、11%vol,編號依次為為G1、G2、G3)、慕薩萊思成品酒(8%vol、10%vol、11%vol 為2016年釀制的葡萄味的穆薩萊思,編號依次為G4、G5、G6,G7為2015年釀制的瓶裝添加大蕓穆薩萊思葡萄酒) 產自新疆阿瓦提縣的刀郎慕薩萊思有限公司;丙醇(純度≥99.5%)、丙酮(純度≥99.5%)、異丙醇(純度≥99.5%) 色譜純,法國Alpha-MOS公司;環己酮(純度≥99.5%)上海東土化工進出口有限公司。

氣相色譜-質譜聯用儀(GC型號7890A;MS型號5975C) 美國Agilent公司;萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美國Supelco公司;FOX4000型電子鼻 法國Alpha-MOS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 電子鼻的檢測條件 取1 mL(用蒸餾水稀釋20倍)的慕薩萊思酒樣于10 mL的電子鼻頂空專用瓶中,每個樣品三次平行,整個過程都在冰上進行。吸取頂空氣體2 mL注入電子鼻系統中,進行檢測分析。其主要檢測參數包括:空氣流速為150 mL/min,數據采集時間為120 s,延滯時間為240 s。

1.2.2 GC-MS的分析條件 樣品制備:準確稱取1.0 g NaCl放置于10 mL的頂空瓶中,分別放入磁力攪拌轉子。依次加入3 mL的慕薩萊思酒樣。每個樣品加入10μL濃度為2μL/mL的環己酮內標液,密封備用。選取50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,將萃取纖維插入放有酒樣的頂空瓶中,置于酒樣液面20 mm的頂空空間,在300 r/min的轉速下萃取20 min(在放入萃取纖維頭前樣品在60 ℃的恒溫下預先平衡20 min,取出手柄,直接進行GC-MS分析,解析時間為3 min。

色譜條件:色譜柱:VF-WAXms(60 m×0.25 mm×0.25 μm);初始溫度為60 ℃,然后以5 ℃/min的升溫速度升至110 ℃,再以3 ℃/min的升溫速度升至215 ℃,保持3 min;再以5 ℃/min的升溫速度升至240 ℃,保持10 min。載氣為氦氣,流量為1.2 mL/min,進樣口溫度為230 ℃,檢測器溫度為240 ℃。

質譜條件:EI電離源,電子能量為70 eV,燈絲流量為0.20 mA。檢測器電壓為350V。掃描范圍為50～550 amu,離子源溫度為230 ℃,傳輸線溫度270 ℃。

1.3 數據處理

采用電子鼻系統自帶的軟件Alpha M.O.S分析軟件,對電子鼻的檢測結果進行分析。將掃描的數據進行處理,主要包括數據的挖掘、校準、歸一化,主成分分析(PCA)以及判別因子分析(DFA)。判別因子分析(DFA)是電子鼻最常用的模式識別方法,它是根據不同樣品所屬類別不同,對原始數據的向量進行線性變換,能夠使不同樣品很好的區分開[9]。而主成分分析(PCA)是將電子鼻不同傳感器提取的總體數據進行轉換和降維,對降維后的特征向量進行分類。通常若樣品信息的總貢獻率超過70%,認為此方法可用[10]。

GC-MS實驗采用內標法,選取環己酮作為內標物對慕薩萊思香氣進行定量分析,根據標準物質的濃度以及峰面積通過公式計算出香氣物質的相對含量。

2 結果與分析

2.1 采用電子鼻技術對慕薩萊思進行區分

本次實驗使用電子鼻系統,通過Alpha M.O.S軟件建立PCA模型,如圖1所示,采用PCA模式識別方法,PC1和PC2的總貢獻率達98.8%,通過PCA降維后,提取的主成分包含了慕薩萊思的絕大部分信息,不同酒精度(8%、10%、11%),從左到右呈現依次遞增趨勢,G4、G5在左側,G6和G7在右側,區分指數DI值達80,區分效果較為理想[11]。如下圖2所示,可以看出經過DFA模型處理后,同組的樣品聚集更接近,不同組之間的距離被放大。DF1和DF2判別因子對整體信息的總貢獻率達97.9%,能夠代表樣品的絕大部分信息,也可以很好地加以區分。

圖1 現代工藝慕薩萊思的PCA模型Fig.1 PCA model of modern technology Musalais

圖2 現代工藝慕薩萊思的DFA模型Fig.2 DFA model of modern technology Musalais

2.2 GC-MS揮發性成分分析

由表2可知慕薩萊思原酒及成品酒中共檢測出揮發性物質164種,G1共檢測出67種揮發性物質;G2共檢測出47種揮發性物質;G3共檢測出55種揮發性物質,G4共檢測出45種揮發性物質;G5檢測出54種揮發性物質;G6共檢測出57種揮發性物質;G7共檢測出51種揮發性物質。其中共有物質16種,包括:1-戊醇、苯乙醇、己酸、辛酸、山梨酸、癸酸、月桂酸、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、5-甲基呋喃醛、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、硬脂酸乙酯、辛酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚構成了慕薩萊思的主體風味物質。從原酒到成品酒中主要的揮發性物質包括醇類、酸類、酯類以及少量的醛類、酮類等。原酒中特有物質有異丁醇、異戊酸甲酯、乙酸異戊酯、苯甲醛、月桂酸乙酯、乙烯基-2-甲氧基苯酚。成品酒中特有的揮發性物質主要有:2,4-二叔丁基苯酚、丁二酸單乙酯、肉豆蔻酸、肉豆蔻酸乙酯、異戊醇、十二醛二甲縮醛。原酒中乙酸異戊酯具有香蕉及水果香;月桂酸乙酯具有花果的芳香氣味;苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅果香。成品酒中肉豆蔻酸、肉豆蔻酸乙酯具有椰子、油脂的香味;異戊醇具有酒精味、成熟果實揮發性氣味。由此可知慕薩萊思原酒及成品酒中主要香氣以花香水果香豐富、具有濃厚的醇香味及焦糖香,此外還有堅果、杏仁味及脂肪香,香氣較為豐富,典型性強。

表2 慕薩萊思揮發性成分分析結果Table 2 Result of Musalaisi volatile components

續表

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2.3 原酒及成品酒揮發性成分含量對比

如下圖3可知,含量較高的物質主要是1-戊醇、苯乙醇等一些高級醇類。G1原酒中還檢測出香葉醇、松油醇這兩種醇屬于萜烯類化合物,主要來源于葡萄原料的品種香。其中含量較高的酯類主要是:辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯等。三個發酵罐中的原酒中酯類物質的種類和含量存在著一定的差異。G1原酒中的總酯類含量相對較高,G3原酒中酯類物質含量較低。可能是三個發酵罐中的原酒的陳釀時間不同,G2原酒陳釀的時間相對較短,一般陳釀時間越長酯類物質會通過酯化作用的緩慢增加。G1中酸類含量最高,其中含量較高的辛酸、癸酸、月桂酸、山梨酸均高于G2和G3。其中G1原酒中(E)-反-2-辛烯醛含量較高為6.71 mg/L,主要來源于葡萄品種,屬于品種香,具有令人愉快的綠葉清香和水果香氣。G1中的2,4-二叔丁基苯酚含量明顯高于G2和G3,其主要來源于一類香氣。

圖3 不同慕薩萊思原酒揮發性成分相對含量比較Fig.3 Comparison of relative contents of volatile components in different wines

如下圖4所示,G6和G7酒樣中醇類物質、酯類物質含量要高于G4和G5。由此可以發現,四種慕薩萊思中醇類、酯類和酸類以及少量的醛類和酮類是其主要的揮發性成分,其中醇類在慕薩萊思酒中占有及其重要的位置,苯乙醇和異戊醇的含量相對較高。G7酒樣中還檢測出特有α-萜品烯、丁香酚等一些含量相對較低的物質,α-萜品烯具有類似樹脂的氣味,而丁香酚具有甘甜的花香和辛香,賦予了慕薩萊思更為豐富的揮發性。此外酮類和醛類物質在慕薩萊思中所占比例雖然很小,但在香氣的感官質量上是形成該產品典型香氣特征的主要揮發性成分,在慕薩萊思產品的特征描述和感官評價上具有重要意義。

圖4 不同酒精度慕薩萊思揮發性成分相對含量比較Fig.4 Different alcohol Musalaisi volatile components relative content

2.4 主成分分析法分析慕薩萊思酒樣中主要揮發性成分

利用SPSS 20.0軟件對慕薩萊思發性成分進行主成分分析,在所有的主成分構成中,信息主要集中在前三個成分中,其累計貢獻率達到99.9%,主成分個數由累計貢獻率達到85%以上為依據。第一主成分的貢獻率為62.179%,第二主成分的貢獻率為21.602%,第三主成分的貢獻率為16.215%,由此可知,這三個主成分包含慕薩萊思揮發性成分的大部分信息,有限的摒除了不重要因素的影響,由表3可知,第一主成分中因子系數較高的有苯乙醇、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、月桂酸、5-甲基呋喃醛,其中苯乙醇的載荷最大,是第一主成分的最重要的影響因子;對第二主成分影響較大的因子是乙酸乙酯、辛酸、癸酸等,對第三主成分影響較大的因子是辛酸乙酯、己酸等。通過SPSS軟件分析可知慕薩萊思中主要的揮發性物質為醇類和酯類,部分醛類的存在對慕薩萊思揮發性成分有負面影響(見圖5),確定出慕薩萊思主要的揮發性成分有苯乙醇、1-戊醇、己酸、辛酸、月桂酸、癸酸、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯等。

表3 成分矩陣Table 3 Component matrix

圖5 旋轉空間中的成分圖Fig.5 Composition diagram rotating in space

通過本次實驗可以發現,原酒中苯乙醇的平均含量為66.761 mg/L,成品酒中苯乙醇的平均含量達108.031 mg/L,1-戊醇的平均含量在原酒和成品酒中變化不大;在原酒和成品酒中含量較高的酸類物質主要有辛酸、山梨酸、癸酸。其中癸酸和辛酸在成品酒中的含量要高于發酵罐的原酒,而山梨酸在成品酒中的平均含量78.987 mg/L要遠高于原酒中山梨酸的平均含量0.691 mg/L,極大可能是成品酒中添加山梨酸鉀防腐劑所導致山梨酸的含量明顯增加。

醇類物質是慕薩萊思的主要揮發性物質,帶有芳香氣味。其中對揮發性成分影響較大主要是高級醇:苯乙醇、1-戊醇、異戊醇等。苯乙醇賦予了慕薩萊思蜂蜜香、玫瑰花香等宜人的香氣,醇類中最重要的是戊醇,由發酵所產生,1-戊醇和異戊醇賦予了慕薩萊思果香及酒香風味。當這些雜醇的含量高于300 mg/L時,會有辛辣刺激性氣味,G4和G5總醇的含量超過了300 mg/L,在口感上辛辣味較重。酯類物質,通常是在發酵過程中產生的二類香氣,有時也是陳釀過程中產生的三類香氣,主要是酵母在生物合成以及陳釀過程中發生酯化作用所產生。在慕薩萊思中酯類物質的種類相當豐富,主要包括:乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、辛酸乙酯等。丁二酸二乙酯主要表現出微弱令人愉快的風味;辛酸乙酯表現出香皂味、蠟燭味;苯乙酸乙酯和乙酸乙酯具有果香味[11]。多種酯類化合物的共同作用會產生較大的風味指數。酸類物質在慕薩萊思中主要來自于葡萄的成熟和酒精發酵過程,影響較大的酸類物質主要有:己酸、辛酸、山梨酸、癸酸。己酸具有類似甜味,辛酸具有脂肪味,酸干酪味。而含量較高的山梨酸少量來源于葡萄原汁中,其余可能在成品酒中人為的添加所致。醛類和酮類物質在慕薩萊思中的含量比很低,但在構成慕薩萊思整體風味中起著非常重要的作用。

2.5 GC-MS與電子鼻實驗結果的相關關系

為了探究GC-MS與電子鼻數據的相關性,本研究利用偏最小二乘法(PLS)建立兩種儀器數據的數學模型,利用模型中決定系數R2的大小來判斷兩種儀器在測定上的相關性[12]。本實驗選取慕薩萊思成品酒(G4、G5、G6、G7)為對象,為了便于數據處理的方便把GC-MS得到不同揮發性物質進行高一級種屬的劃分。總共劃分為4大類物質:醇類,酯類,酸類和醛類,并將不同揮發性物質的相對含量按照劃分種屬進行合并。這樣的劃分是數據具有代表性,并且更利于清晰PLS模型的建立。具體劃分結果和各種物質相對含量見下表4,根據PLS模型的原理,將電子鼻的十八根傳感器進行歸類,根據電子鼻對不同揮發性物質的敏感性,歸為四大類。以電子鼻傳感器數據為自變量,以GC-MS得到的四大類化合物的相對含量為因變量來建立模型,根據決定系數R2的大小來判斷模型的可靠性和兩種儀器的相關性。R2數值越高,證明兩種儀器得到的數據相關性越高,模型可靠性和適用性越高。

表4 GC-MS 檢測幾大類揮發性化合物的相對含量Table 4 The relative contents of several categories of volatile compounds based on GC-MS datas

下圖6,PLS模型圖反映了醇類、酸類、酯類和醛類四大類物質的實際含量與模型的預測含量之間的關系。G4、G5、G6、G7四個酒樣的R2值依次為0.93、0.94、0.92、0.93。可以看到四個方程的R2均大于 90.0%,并且 PLS 模型的實際值和預測值表現良好。說明 GC-MS 與電子鼻實驗數據在區分不同慕薩萊思成品酒方面具有高度的相關性。

圖6 電子鼻和GC-MS得到的揮發性物質實際值與預測值的PLS模型結果Fig.6 The PLS results for the actual and predicted responses of the content of volatile compounds based on E-nose and GC-MS datas

3 結論

通過對不同酒精度的成品酒進行電子鼻檢測,結果表明電子鼻可以有效地區分以上酒種。PCA模型的得分在80～100之間被認為是比較好的,表明對樣品能夠很好的區分開來。DFA模型主要用來預測未知樣品,結合使用PCA模型和DFA模型可以有效建立區分辨別不同種類的慕薩萊思。本文中建立基于電子鼻技術對慕薩萊思以及葡萄濃縮汁快速的區分鑒別方法是可行的。

通過主成分分析可知,慕薩萊思中醇類、酯類以及酸類物質是最主要的揮發性組成成分。此外還有酮類、醛類、酚類以及萜烯類等其他揮發性物質含量相對較低,但也共同參與構成慕薩萊思香氣物質的感官特異性,對整體揮發性成分的貢獻也非常重要。對慕薩萊思揮發性成分貢獻較大的物質有苯乙醇、苯乙酸乙酯、己酸、丁二酸二乙酯等。

GC-MS的定量分析結果表明,不同種類的慕薩萊思均能引起葡萄酒中不同香氣濃度的差異,從而引起慕薩萊思之間揮發性成分的差異,該差異能夠被電子鼻識別區分。GC-MS 與電子鼻數據結果建立的 PLS 模型決定系數均大于 90.0%,具有很好的相關性。采用具有“模糊評價”屬性的電子鼻技術結合具有“精準檢測特性”的GC-MS分析方法可以對不同酒精度的慕薩萊思進行區分。