蘇氨酸鐵對缺鐵性貧血大鼠 鐵營養狀況的改善

李 虎,謝明勇,王光然,虞俊翔,易成意,胡曉波

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

鐵是人和動物體內不可或缺的微量元素之一,鐵缺乏或利用障礙均會導致貧血發生,若患者僅為輕度貧血,通過日常飲食及藥物幫助可恢復正常[1]。缺鐵性貧血(IDA)是貧血的一種,是當前世界范圍內患病率較高的營養性疾病,特別是在發展中國家[2-3]。一般情況下,較低的膳食鐵含量和生物利用率易造成鐵缺乏,使紅細胞中血紅蛋白(Hb)含量大幅減少,進而降低紅細胞數目,造成細胞及組織供氧不足,最終出現缺鐵性貧血[4-5]。

通過對膳食中鐵含量進行強化來預防和治療鐵缺乏被廣泛地認為是最為有效的方法[6]。傳統鐵強化劑或多或少地存在鐵腥味,對胃腸道的刺激性較大,生物利用率也不理想[7],因此有必要開發新型補鐵制劑。氨基酸鐵螯合物具有溶解性好、穩定性強、吸收快、無毒害作用、無刺激性等特點,具有較高的生物利用率和生物學效價[8-10]。在治療和改善IDA時,氨基酸螯合鐵具有優于無機鐵和有機酸鐵的應用性能[11]。Cristina lost等[12]針對IDA兒童研究發現,食用氨基酸螯合鐵強化的液體奶可以緩解IDA兒童Hb水平較低的癥狀。江素梅[13]在預防仔豬貧血的研究中對仔豬或母豬飼喂氨基酸鐵,能直接或間接預防仔豬貧血,提高免疫力。

實驗以初斷乳斯潑累格·多雷(SD)大鼠建立IDA模型,通過對IDA大鼠補充蘇氨酸鐵(Thr-Fe),并以硫酸亞鐵為陽性對照,對低鐵膳食補充Thr-Fe改善IDA大鼠鐵營養狀況及其對血液理化指標水平的改善效果展開研究,從而為Thr-Fe在改善和糾正IDA的應用中提供理論和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級初斷乳SD大鼠 雄性,36 只,3 周齡,體重(69.30±5.28) g,健康狀況良好,符合實驗所需的質量要求,許可證號:SCXK(湘)2013-0004,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;蘇氨酸鐵 淺綠色粉末,亞鐵含量為12.07%,南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室研制;七水合硫酸亞鐵 分析純,亞鐵含量為19.88%,西隴化工股份有限公司;普通飼料 鐵含量為260 mg/kg,成分:玉米粉58.5%,麥麩7.5%,豆粕23.5%,進口蒸汽紅魚粉3.0%,蔗糖3.0%,大豆油2.0%,乳脂粉2.0%,預混料3.5%,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;低鐵飼料 鐵含量<10 mg/kg,成分:EDTA處理酪蛋白15%,大米粉70%,玉米油5%,AIN-76M混合礦物鹽3.5%,AIN-76M混合維生素1%,氯化膽堿0.2%,明膠5%,DL-蛋氨酸0.3%,北京博泰宏達生物技術有限公司;原卟啉標準品 純度≥ 95%,上海麥克林生化科技有限公司;大鼠血紅蛋白酶聯免疫分析試劑盒 上海撫生實業有限公司;大鼠總鐵結合力ELISA試劑盒、大鼠轉鐵蛋白ELISA試劑盒、大鼠鐵蛋白ELISA試劑盒 南京翼飛雪生物科技有限公司。

超低溫冰箱 日本Sanyo公司;普通臺式離心機 德國Eppendorf公司;臺式低溫高速離心機 德國Heraeus公司;OLYMPUS AU640全自動生化分析儀 日本奧林巴斯電氣化學公司;渦旋振蕩器 常州萬合儀器制造有限公司;E-330多功能酶標儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠IDA模型建立 實驗采用不銹鋼籠及塑料水罐避免鐵元素的污染,大鼠自主飲水采食,控制室溫22 ℃左右,每日給予12 h光照,室內換氣次數約12 次/h。適應環境3 d后,選用健康初斷乳SD大鼠30只,飼予低鐵飼料及去離子水建立缺鐵性貧血模型。自第3周開始,每隔5 d隨機選取部分大鼠(20只),眼眶后靜脈叢采血,測定Hb。若Hb<100 g/L,則認為該實驗動物已發生缺鐵性貧血。當隨機選取的大鼠全部達到恢復實驗要求(即Hb<100 g/L)時,認為建模成功,此時測定全部大鼠Hb并稱重,記錄體重。

1.2.2 SD大鼠IDA恢復實驗 選取Hb<100 g/L的大鼠30只,根據Hb水平及體重將其隨機分為Thr-Fe低、中、高劑量組、陽性對照組和低鐵對照組,每組6只,均繼續給予低鐵飼料;另設空白對照組,6只,給予普通飼料。Thr-Fe低、中、高劑量組分別給8、16、32 mg/kg·bw 的Thr-Fe,陽性對照組給予32 mg/kg·bw硫酸亞鐵,低鐵對照組和空白對照組給予相應溶劑(新沸冷卻超純水,現用現配),容積為1.0 mL/100 g·bw,采用灌胃給藥的方式,每天1次。受試樣品給予時間為21 d,每周測定兩次體重及Hb,并根據體重調整灌胃的容積。采集血液樣品之前,實驗動物需禁食12 h。日常采血選擇眼眶后靜脈叢采血,實驗動物處死前選擇摘眼球采血,采集到的血液樣品置于EDTA抗凝管中,部分血液離心制備血清,4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 測定指標

1.2.3.1 實驗動物一般情況 觀察實驗過程中SD大鼠的精神狀態、活動能力、被毛等情況,稱量各組大鼠體重。

1.2.3.2 血液學指標 使用大鼠血紅蛋白酶聯免疫分析試劑盒,采用雙抗體夾心法測定IDA大鼠血液的Hb水平。利用全自動生化分析儀測定血紅細胞(RBC)計數、白細胞(WBC)計數、紅細胞比容(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞分布寬度(RDW)。

1.2.3.3 紅細胞內游離原卟啉含量(FEP) 參照楊煥民等[14-15]關于仔豬紅細胞內游離原卟啉微量測定法及正常值探討的相關報道,采用熒光分光光度法測定FEP。

1.2.3.4 血清鐵蛋白(SF)、轉鐵蛋白(TRF)、總鐵結合力(TIBC) 使用大鼠鐵蛋白ELISA試劑盒、大鼠轉鐵蛋白ELISA試劑盒、大鼠總鐵結合力ELISA試劑盒,采用雙抗體夾心法測定IDA大鼠血清樣品中SF、TRF及TIBC水平。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 實驗動物一般情況分析

IDA模型建立期間,模型組與空白對照組相比采食量下降,體重增加緩慢,活動能力降低,易脫毛,且模型組部分大鼠出現毛發成片脫落現象。恢復實驗期間,Thr-Fe劑量組以及陽性對照組實驗動物與空白對照組比較精神狀態均出現一定程度的萎靡,毛發粗糙凌亂、無光澤,可能由于恢復實驗期短,而實驗動物皮毛狀況的改善需要較長時間。

2.2 Thr-Fe對IDA大鼠體重的影響

IDA模型建立初始時間記為第0 d,恢復實驗初試時間記為第1 d。實驗期間動物體重變化見表1。

表1 IDA大鼠體重Table 1 Body weight of IDA

恢復實驗過程中,各模型組間體重差異無統計學意義(p>0.05)。恢復實驗結束時,低鐵對照組大鼠體重較空白對照組差異極顯著(p<0.01),Thr-Fe高劑量組較低鐵對照組,差異顯著(p<0.05),各模型組中Thr-Fe高劑量組增量最高,且與陽性對照組和低鐵對照組相比,體重增量的差異極顯著(p<0.01)。其他模型組間大鼠的體重增量無統計學差異(p>0.05)。實驗結果表明IDA對實驗動物體重有重要影響;較硫酸亞鐵,高劑量Thr-Fe鐵能明顯改善IDA大鼠體重增長緩慢的癥狀,與劉衛東等[16]在斷奶仔豬實驗組飼糧中添加0.05%甘氨酸亞鐵,實驗組較對照組(無機鐵)日增重提高9.1%的研究結果一致。由此推斷,高劑量Thr-Fe作為補鐵劑改善和糾正IDA時,可以促進患者體重增長且效果優于硫酸亞鐵。

2.3 Thr-Fe對IDA大鼠血液學指標的影響

2.3.1 恢復實驗期間Thr-Fe對IDA大鼠Hb水平的影響 實驗動物在恢復實驗期間Hb含量變化見表2。

表2 恢復實驗期間IDA大鼠血紅蛋白含量Table 2 Hb content in IDA rats during recovery

鐵制劑干預的IDA大鼠血液Hb隨恢復實驗的進行呈上升趨勢,且隨劑量的增加,Thr-Fe劑量組間相比,Hb含量也增高。恢復實驗第15 d,Thr-Fe低、中、高劑量組和陽性對照組的Hb水平較低鐵對照組分別增高了12.83%、29.15%、40.06%和27.73%(p<0.01),第21 d,則分別增高了22.30%、37.68%、56.88%和39.79%(p<0.01)。Thr-Fe高劑量組的Hb含量于恢復實驗第21 d較空白對照組無統計學差異(p>0.05),較陽性對照組增高了13.16%(第15 d,p<0.05)和12.23%(第21 d,p<0.05)。結果表明,連續補充一定劑量Thr-Fe可提高大鼠血液Hb水平,改善血液狀況,與丁科等[17]關于甘氨酸亞鐵可明顯增加IDA大鼠血液Hb含量且效果優于硫酸亞鐵的研究結論一致。Thr-Fe對IDA大鼠血液Hb的改善作用與劑量呈正相關,此外Thr-Fe的應用性能優于硫酸亞鐵。

2.3.2 Thr-Fe對IDA大鼠血常規檢查指標的影響 血常規指標是大鼠喂養實驗的一項重要內容[18],也是判斷外源性受試物是否對動物血液組織造成影響的重要依據[19]。通過全自動生化分析儀測定各組大鼠血液中RBC、WBC、HCT、MCV、MCH、RDW指標,測定結果見表3。

表3 大鼠血常規測定結果Table 3 Results of the blood routine examination of the

各Thr-Fe劑量組IDA大鼠間以及與陽性對照組比較,血常規指標差異無統計學意義(p>0.05)。低鐵對照組大鼠各指標較空白對照組差異極顯著(p<0.01)。鐵制劑干預各組的RBC、WBC、HCT、MCV、MCH較低鐵對照組,差異均有統計學意義:Thr-Fe各劑量組和陽性對照組RBC、MCV、MCH升高極顯著(p<0.01),Thr-Fe高劑量組和陽性對照組WBC升高極顯著(p<0.01),Thr-Fe低、中劑量組升高顯著(p<0.05)。鐵制劑干預各組的RDW值較低鐵對照組明顯改善,分布寬度變窄。鐵制劑干預的各組大鼠血常規指標較低鐵對照組有明顯糾正,RBC、WBC增加,MCV、HCT等值變大,RDW明顯降低,接近于空白對照組,紅細胞形態差異減小,缺鐵癥狀得到改善。這與袁明貴等[20]關于甘氨酸鐵絡合物對杜長大仔豬血常規指標具有改善作用的研究結論一致。

2.4 Thr-Fe對IDA大鼠血液FEP水平的影響

恢復實驗結束后,各組大鼠FEP含量測定結果見表4。

表4 IDA大鼠紅細胞內游離原卟啉 含量測定結果Table 4 Results of FEP of IDA

低鐵對照組大鼠FEP含量顯著高于空白對照組(p<0.01),鐵制劑干預各組FEP含量較低鐵對照組差異極顯著(p<0.01),Thr-Fe高劑量組和陽性對照組大鼠FEP含量分別降低了28.59%和28.03%,接近空白對照組。Thr-Fe各劑量組大鼠FEP水平與陽性對照組相比較均無統計學差異(p>0.05)。隨劑量增加,Thr-Fe劑量組大鼠FEP含量降低,與劑量呈負相關。FEP含量是表征鐵缺乏的可靠指標之一,從補充Thr-Fe和硫酸亞鐵使細胞內游離FEP含量顯著下降,可以推斷IDA大鼠體內耗竭的功能鐵得到部分恢復,促進了機體血紅素的合成,改善了鐵營養狀況,缺鐵性貧血造成的機體鐵依賴性生理功能損傷得到緩解。

2.5 Thr-Fe對IDA大鼠SF、TRF、TIBC的影響

恢復實驗后,各組大鼠血清SF、TRF、TIBC測定結果見表5。

表5 Thr-Fe對IDA 大鼠SF、TRF、TIBC的影響(n=6,x±s) Tab 5 Effects of Thr-Fe on the SF、TRF、TIBC levels IDA rats(n=6,x±s)

低鐵對照組大鼠SF、TRF、TIBC較空白對照組差異顯著(p<0.05)。較低鐵對照組,Thr-Fe高劑量組和陽性對照組大鼠SF含量分別顯著性升高26.94%(p<0.01)和22.85%(p<0.05)。Thr-Fe高劑量組TRF含量較低鐵對照組降低了26.74%(p<0.01),接近空白對照組(p>0.05),各Thr-Fe處理組大鼠的血清TRF含量隨劑量的增加呈降低趨勢。較低鐵對照組,各劑量組血清TIBC均有不同程度的降低,且隨Thr-Fe劑量的增加呈降低趨勢,其中Thr-Fe高劑量組TIBC較低鐵對照組下降了21.63%(p<0.05),接近空白對照組。血清鐵蛋白中鐵主要以Fe3+的形式存在,通過Fe2+攝取或Fe3+釋放來調節機體鐵穩態[21],同時轉鐵蛋白參與鐵在體內的轉運和代謝,機體健康變化會導致轉鐵蛋白含量的變化[22]。通過鐵元素的補充,SF合成增加,TRF合成減少,TIBC降低,較低鐵劑量組均有較為顯著的改善,特別是高劑量的Thr-Fe使IDA大鼠在短期內SF、TRF和TIBC水平達到正常范圍,有效地促進了機體內鐵的轉運和貯存。

3 討論

鐵缺乏致使與鐵有關的多種酶活降低,影響機體氧化還原等生理過程[23-24],對免疫、消化及內分泌等系統均產生較大負面影響[25],患者易出現焦慮、沮喪等情緒。模型建立及恢復實驗過程中,受鐵缺乏的影響,模型組大鼠較空白對照組表現出采食減少,體重增加緩慢,活動能力低,易脫毛,精神萎靡等現象,表明IDA對實驗動物有一定影響。通過對各模型組分別飼喂Thr-Fe和硫酸亞鐵,大鼠體重增加狀況較低鐵劑量組均有明顯改善,這與王明鎮等發現補充氨基酸螯合鐵可有效增加斷奶仔豬體重的結論一致[26]。這可能與隨著鐵元素的補充,大鼠體內鐵營養狀況改善,與鐵有關的酶活逐漸恢復并發揮正常生化作用,從而大鼠紊亂的生理代謝活動得到糾正有關。

實驗期間針對模型組大鼠飼喂低鐵飼料,造成早期的營養性鐵缺乏,進而影響血紅素生成不足,未能與鐵結合的FEP含量增高[27],Hb合成量減少,大鼠紅細胞內血紅蛋白含量不足,紅細胞間差異變大,RDW值升高[28],MCH、MCV等值降低,此外,中性粒細胞殺菌能力下降,淋巴細胞功能受損[29],WBC一定程度降低。缺鐵對細胞分裂增殖影響較小,故RBC減少程度不如Hb明顯。恢復實驗中,鐵元素經小腸上皮細胞吸收和轉運蛋白轉運后,與紅細胞內游離的原卟啉結合,FEP值降低,血紅素合成量增加,以血紅素為合成原料的Hb含量升高,大鼠血常規指標恢復到與王蕊[30]等報道的10～12 周齡SD大鼠血常規指標參考水平趨近一致。

血清鐵蛋白復合物在一定程度上維持血紅蛋白的穩態,當鐵儲備不足時,合成的鐵蛋白降低,TIBC升高,轉鐵飽和度降低[31]。鐵制劑的補充促進了大鼠體內血清鐵蛋白復合物生成,儲備鐵含量增加,轉鐵蛋白含量和總鐵結合力下降,結果與張文飛研究報道的甘氨酸亞鐵能顯著提高血清中鐵飽和度和血液中鐵含量一致[32]。

4 結論

由實驗結果與討論可知,不同劑量Thr-Fe對IDA大鼠各項指標的影響有一定差異,高劑量Th-Fe較中、低劑量對大鼠鐵營養狀況的改善作用更明顯,實驗結束時的各項指標更接近空白對照組;高劑量Thr-Fe組大鼠較陽性對照組鐵營養狀況改善較好,這可能與Thr-Fe較硫酸亞鐵穩定性更強、吸收利用率更高有關。

綜上所述,低鐵膳食補充Thr-Fe可以改善IDA大鼠的鐵營養狀況,提高功能鐵、貯存鐵水平,促進機體內鐵運轉,另外對體重、血液品質具有一定改善作用,改善效果與補充劑量呈相關性,并且高劑量Thr-Fe作用效果優于硫酸亞鐵。因此,Thr-Fe作為鐵營養強化劑應用于改善和糾正IDA具有廣泛的前景。