輪葉黨參粗多糖對體外培養小鼠脾淋巴細胞 及RAW 264.7細胞的免疫活性

張 妍,邵玉健,黃 睿,林昌岫,康東周,*

(1.延邊大學 藥學院,吉林延吉 133002;2.延邊大學附屬醫院中心實驗室,吉林延吉133000)

輪葉黨參(Codonopsislanceolata)又名山胡蘿卜、山地瓜、羊乳等,為桔梗科黨參屬藥用植物,以根入藥,是長白山珍貴的藥食兩用的植物[1]。我國傳統醫學認為輪葉黨參可以強身壯力、補虛潤肺、通乳排膿、解毒療瘡的功效[2],而據現代醫學研究,輪葉黨參具有抗癆病、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、抗突變等作用[3]。

植物多糖是從天然植物中提取的一種具有生物活性的物質,經研究發現,許多植物多糖都具有提高機體免疫功能的作用,并進行了深入地研究,而輪葉黨參粗多糖對機體免疫機能方面研究卻鮮少有報道。所以,研究輪葉黨參粗多糖相關免疫調節作用對于輪葉黨參保健功能的開發具有很大的意義。

本文旨在研究輪葉黨參粗多糖對小鼠脾淋巴細胞特異性免疫功能及RAW 264.7作用下非特異性免疫功能的影響,為輪葉黨參粗多糖的開發和利用建立基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

輪葉黨參 經延邊大學藥物分析教研室康東周副教授鑒定為長白山道地藥材輪葉黨參。6～8周齡BALB/C小鼠 延邊大學動物實驗中心;RAW 264.7 武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶 美國Hyclong公司;RPMI-1640培養基 賽默飛世爾生物化學制品有限公司;MTT、DMSO、磷酸鹽緩沖溶液 北京索萊寶公司;小鼠細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒 美國BD公司;LPS、NEDD、Sulfanilamide、ConA 美國sigma公司;RT-PCR試劑盒 Promega公司。

酶聯免疫檢測儀 美國伯騰儀器有限公司;二氧化碳培養箱 Thermo公司;低溫高速離心機 BECKMAN公司;倒置顯微鏡 Olympus公司;超凈工作臺 BIOAIR公司;PCR儀 BIO-RAD公司;凝膠成像儀 Proteinsimple公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠脾臟細胞制備 脫頸處死BALB/C小鼠,于75%乙醇中完全浸泡2 min,在無菌環境下取出小鼠脾臟,將脾臟置于200目銅篩上邊研磨邊用RPMI-1640培養基沖洗過濾,收集濾液于4 ℃ 1000 r/min離心后棄上清,再用RPMI-1640培養基沖洗、吹打,自離心至吹打如此過程重復三次即得小鼠脾臟細胞[4]。

1.2.2 輪葉黨參粗多糖及溶液的制備 采用水提醇沉法,料液比為1∶10,水提溫度80 ℃,浸提3 h,40 ℃濃縮,加入乙醇至乙醇終濃度為65%[5]。醇沉后,丙酮、乙醚洗滌沉淀,用Savage法除蛋白[6],經冷凍干燥得輪葉黨參粗多糖。將輪葉黨參粉末按相應濃度溶于含10% FBS RPMI-1640培養基中,無菌環境用0.3 μm濾膜過濾。

1.2.3 脾淋巴細胞分組與培養

1.2.3.1 實驗分組 正常組(只含細胞),陽性對照組(ConA終濃度為5 μg/mL),用藥組(ConA+輪葉黨參粗多糖,ConA終濃度為5 μg/mL,多糖終濃度分別為1000、500、250、125 μg/mL,用藥組各含5 μL/mL ConA)。

1.2.3.2 ELISA法檢測IL-2、IFN-γ分泌水平 將剛分離的小鼠脾臟細胞以2.5×106個/孔接種于48孔(終體積為400 μL)細胞培養板中,培養4 h后,按分組給藥,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養72 h,用ELISA法檢測細胞上清液中IL-2,IFN-γ濃度。

1.2.4 RAW 264.7分組與培養

1.2.4.1 實驗分組 正常組(只含細胞),陽性對照組(LPS終濃度為2 μg/mL),用藥組(輪葉黨參粗多糖終濃度為1000、500、250、125 μg/mL)。

1.2.4.2 RAW 264.7 的細胞增殖活性測定 將RAW 264.7以1×104個/孔接種于96孔(終體積為200 μL)細胞培養板中,培養4 h后,按分組給藥,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養24 h。加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)培養箱孵育4 h后,吸出細胞上清,每孔加入100 μL DMSO溶解,在570 nm波長處測定吸光度。

細胞相對增殖率(%)=(實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值)×100

1.2.4.3 ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平 將RAW 264.7細胞以2.5×105個/孔接種于48孔(終體積為400 μL)細胞培養板中,培養4 h后,按分組給藥,置于37 ℃,5%CO2培養箱中培養48 h,收集細胞上清液用ELISA法檢測細胞上清液中IL-2、IFN-γ濃度。

1.2.4.5 RT-PCR法檢測iNOS mRNA的表達 將RAW 264.7細胞以2×106個/孔接種于48孔(終體積為400 μL)細胞培養板中,培養4 h后,分組給藥,劑量組質量濃度為1000 μg/mL,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養24 h,棄上清。mRNA的提取,RNA逆轉錄與cDNA合成的方法均按照試劑盒說明書進行。引物序列β-actin:反義:5′-CAGGTCCCGG CCAGCCAGGT -3′;正義:5′-CACCCGCCACCAG TTCGCCA-3′;iNOS:反義:5′-CTCCTTTGAGCCC TTTGT -3′;正義:5′-GAGCGAGTTGTGGATTGTC-3′。按照以下參數進行PCR 擴增反應:β-actin:先 95 ℃ 預變性5 min,然后95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,30個循環,最后一個循環72 ℃ 7 min。iNOS:先95 ℃預變性5 min,然后95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35個循環,最后一個循環72 ℃ 7 min。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細胞IL-2生成量的影響

不同濃度的輪葉黨參粗多糖和5 μg/mL ConA作用于脾淋巴細胞后,IL-2生成量極顯著高于正常組(只含細胞)與陽性對照組(ConA組)(p<0.01),見表1。ConA具有刺激脾淋巴細胞增殖的作用,使得在陽性對照組中ConA的作用下,IL-2濃度極顯著高于正常組(p<0.01)。而在劑量組中,與陽性對照組相比,IL-2濃度隨著劑量的加大而增加。表明在劑量為125～1000 μg/mL范圍內,輪葉黨參粗多糖可以發揮協同作用,極顯著促進ConA誘導的脾淋巴細胞分泌IL-2(p<0.01)。

表1 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細胞 分泌IL-2的影響Table 1 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IL-2 production by mouse spleen

2.2 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細胞IFN-γ生成量的影響

不同濃度的輪葉黨參粗多糖和5 μg/mL的ConA作用于脾淋巴細胞后,IFN-γ生成量極顯著高于正常組與陽性對照組(ConA組)(p<0.01),見表2。ConA具有刺激脾淋巴細胞增殖的作用,使得在陽性對照組中ConA的作用下,IFN-γ濃度極顯著高于正常組。而在各劑量組中,與陽性對照組相比,IFN-γ濃度隨著劑量的加大而增加。表明在劑量為125～1000 μg/mL范圍內,輪葉黨參粗多糖可以發揮協同作用,極顯著促進ConA誘導的脾淋巴細胞分泌IFN-γ(p<0.01)。

表2 輪葉黨參粗多糖對脾淋巴細胞分泌 IFN-γ的影響Table 2 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IFN-γ production by mouse spleen

2.3 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7細胞的增殖的影響

由表3可得,不同濃度的輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7細胞與正常組比較增殖作用顯著(p<0.05)。劑量濃度為125～1000 μg/mL時,均顯著有細胞增殖能力。當劑量濃度為250或500 μg/mL時,其增殖效果相近。而濃度為1000 μg/mL時,促進細胞增殖能力最大。

表3 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7細胞的 增殖的影響Table 3 Proliferation effect of Codonopsis lanceolata polysaccharide on cultured RAW

2.4 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 TNF-α、IL-6生成量的影響

由表4、表5可得,不同濃度的輪葉黨參粗多糖作用于RAW 264.7細胞后,TNF-α,IL-6濃度極顯著高于正常組(p<0.01)。可見在劑量濃度在125～1000 μg/mL范圍內時,TNF-α,IL-6分泌量增加效果明顯,甚至高于LPS組。當多糖質量濃度為 1000 μg/mL時,TNF-α,IL-6生成量最大。

表4 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 分泌TNF-α的影響Table 4 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on TNF-α production by RAW

表5 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 分泌IL-6的影響Table 5 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IL-6 production by RAW

2.5 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 NO生成量的影響

由表6可得,不同濃度的輪葉黨參粗多糖作用于RAW 264.7細胞后,NO生成量極顯著高于正常組(p<0.01)。可見在劑量濃度在125～1000 μg/mL范圍內時,NO分泌量增加明顯,甚至高于LPS組,且隨著濃度劑量增加而增多。當多糖質量濃度為 1000 μg/mL時,NO生成量最大,作用最顯著。

表6 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 分泌NO的影響Table 6 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on NO production by RAW

2.6 輪葉黨參粗多糖對RAW 264.7 iNOS mRNA表達的影響

由圖1可知,輪葉黨參劑量為1000 μg/mL時,iNOS中LPS組與輪葉黨參多糖組光斑強度明顯高于正常組,且β-actin中各組量接近。由此得出,RAW 264.7在輪葉黨參粗多糖的作用下可增加對iNOS mRNA的生成。而輪葉黨參粗多糖可能通過提高RAW 264.7 iNOS mRNA表達,調節增加NO的釋放量。

圖1 輪葉黨參多糖作用RAW 264.7 細胞后,iNOS mRNA的表達Fig.1 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on iNOS mRNA production by RAW 264.7

3 討論

脾臟是人體最大的免疫器官,含有大量淋巴細胞與巨噬細胞,參與特異性免疫與非特異性免疫應答[7]。ConA可以刺激脾臟細胞中脾淋巴細胞,是T細胞促有絲分裂劑,主要參與特異性免疫應答,可以刺激脾臟細胞中脾淋巴細胞。IL-2是機體發揮重要調節作用的細胞因子,主要由淋巴細胞產生,其在免疫調節中尤其是特異性免疫方面起重要作用。IL-2可以參與T淋巴細胞的增殖與分化,增強一些細胞活性,例如:Tc細胞、NK細胞和LAK細胞活性等[8],并且可誘導IFN-γ的產生。而IFN-γ具備免疫調節的活性[9],可增強T淋巴細胞與B淋巴細胞免疫功能[10]。Wang 等[11]實驗證明大葉南五味子多糖能夠體外刺激雞脾淋巴細胞分泌IL-2,IFN-γ來調節機體免疫機能。鄭乃珍等[12]研究表明猴頭菇多糖能夠協同ConA對小鼠脾細胞分泌Th1(IL-2、TNF-α、INF-γ)、Th2(IL-6、IL-4)細胞因子及基因表達的影響從而促進機體雙重免疫調節。王思蘆等[13]報道雞樅菌多糖可明顯促進小鼠脾淋巴細胞分泌IL-4、IL-2、INF-γ細胞因子,增強小鼠T細胞免疫功能的影響。

IL-6能誘導活化B細胞,促使其分泌抗體,參與T細胞的活化、增殖及分化[14]。TNF-α增強巨噬細胞的活性和殺傷功能增強巨噬細胞促免疫應答的能力[15-16]。NO被認為是一種重要的活性介質,免疫系統產生的NO分子在宿主免疫防御、組織修復等生理活動中發揮重要的作用[17]。巨噬細胞生成的NO具有細胞毒作用,既可殺傷侵入機體的有害物質,又能夠抑制癌細胞的增殖[18]。楊修仕等[19]研究顯示西洋參多糖可促進巨噬細胞分泌NO、TNF-α、IL-6及IL-10細胞因子,因而具備較強免疫活性。郝慧慧等[20]研究表明紅毛五加多糖可促進巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α、NO,增強巨噬細胞吞噬能力,可活化巨噬細胞,起到免疫正向調節作用。巨噬細胞對非特異性免疫發揮重要作用,可以通過分泌各種細胞因子來調節機體免疫能力[21]。NO的合成主要受一氧化氮合酶(NOS)的調節。NOS有三種亞型,即nNOS,eNOS,iNOS[22]。楊興斌等[23]研究證明當歸多糖通過增強表達iNOS mRNA,合成蛋白質來誘使巨噬細胞分泌NO。

4 結論

本文中輪葉黨參粗多糖可以促進脾淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ,濃度極顯著高于陽性對照組(p<0.01),即可認為輪葉黨參粗多糖為T細胞功能的促進劑,與ConA協同作用于T淋巴細胞,具有增強T細胞免疫活性的功能。輪葉黨參粗多糖也可顯著促進RAW264.7的增殖(p<0.05),極顯著增加RAW264.7分泌IL-6、TNF-α、NO(p<0.01),即可說明輪葉黨參粗多糖可活化、增強巨噬細胞活性等作用,從而發揮增強非特異性免疫的作用。同時,本文還檢測了iNOS mRNA的表達,結果證明其能夠明顯增強巨噬細胞iNOS mRNA的表達水平,提示輪葉黨參粗多糖通過促進巨噬細胞iNOS mRNA的表達,從而提高NO的生成。綜上表明,輪葉黨參粗多糖可增加脾淋巴細胞與RAW264.7分泌IL-2、IFN-γ、IL-6、TNF-α、NO,促進RAW 264.7增殖,iNOS mRNA表達,對以T細胞與巨噬細胞發揮主要作用的特異性免疫與非特異性免疫活性有正向調節的作用,為輪葉黨參的進一步研究奠定了一定的理論基礎。