益生菌抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

陳　贊，林　朗，楊宗哨，李丕宏，陳上住

(1.蒼南縣人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325800；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 普外科，浙江 溫州 325000)

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，全球結(jié)腸癌的發(fā)生率和死亡率位于惡性腫瘤的第三位[1-3]。細(xì)胞生長增殖失調(diào)是腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制之一[4-5]，腸道微生物種群及宿主與微生物的相互作用可能是結(jié)腸癌發(fā)生另一重要機(jī)制[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌和長雙歧桿菌具有多種益生作用，如阻止致病菌定植、誘發(fā)腸道免疫、降低膽固醇、控制內(nèi)毒素、制造營養(yǎng)物質(zhì)、刺激組織發(fā)育等。本研究旨在探討嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長雙歧桿菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制。

1　材料和方法

1.1試劑和儀器益生菌菌種購自美國菌種保藏中心(ATCC)公司，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，兔抗人Bax多克隆抗體、抗GAPDH抗體購自Abcam公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自Corning公司，垂直電泳儀、BCA蛋白測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，qRT-PCR試劑盒購自Takara公司，PCR儀購自ABI公司。

1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞購于美國ATCC公司，接種于含10%胎牛血清(含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)的改良型RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行研究。

1.3菌體成分制備將純化并鑒定后的嗜酸乳桿菌(ATCC 4356)、乳雙歧桿菌(CGMCC1.2226)和長雙歧桿菌(ATCC 15708)接種于皰肉培養(yǎng)基(無水硫酸鎂0.1 g，多胨12 g，磷酸氫二鈉11 g，植胨3 g，酵母粉3 g，硫代硫酸鈉1.0 g，可溶性淀粉3 g，牛肉渣1 g，pH 7.8，高壓滅菌121 ℃，15 min)進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到足量的益生菌菌體濃度后通過超聲破碎及高速低溫離心，分離得到細(xì)菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)成分。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 RPMI1640 培養(yǎng)液重懸SW-480細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL、每孔100 μL接種到96孔板。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入益生菌活菌體、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量。益生菌活菌體細(xì)胞數(shù)與SW-480細(xì)胞數(shù)比例分別為 1∶1、10∶1、50∶1，益生菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的濃度分別為10、50、100、200 μg/mL。每組設(shè)置五個(gè)復(fù)孔，每組空白對(duì)照不加任何處理因素。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，37 ℃培養(yǎng)48 h后加入5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后棄去細(xì)胞上清液體，再向各孔中加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)震蕩孵育10 min。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值，抑制率 =(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/空白對(duì)照吸光值)×100 %。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)Bcl-2表達(dá)將SW480細(xì)胞37 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后，利用Trizol法提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，參照試劑盒說明進(jìn)行操作。通過qRT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，GAPDH上游引物5'-GACCCCTTCATTGACCTCAA-3'，下游引物5'-TGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'。Bcl-2上游引物5’-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’，下游引物5’- GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3’。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量。

1.6Western blot法檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)將SW480細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后，預(yù)冷PBS沖洗2次后加入100 μL的細(xì)胞裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑10 mg/mL)提取總蛋白，按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)操作，兔抗人的Bax多克隆抗體(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)稀釋，以GAPDH為內(nèi)參照，加化學(xué)發(fā)光劑顯色，Bax蛋白表達(dá)情況通過Image J軟件計(jì)算蛋白灰度進(jìn)行量化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1益生菌菌體對(duì)SW-480細(xì)胞增殖的影響嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長雙歧桿菌菌體分別與SW-480細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，均抑制SW-480細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，見表1。

表1　益生菌菌體對(duì)人結(jié)腸癌

2.2益生菌細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞的抑制作用10、50、100、200 μg/mL的益生菌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁成分分別作用于SW-480細(xì)胞48 h，分析對(duì)SW-480細(xì)胞抑制率計(jì)算各組半抑制濃度(IC50)值。三組益生菌細(xì)胞壁成分的抑制作用均大于細(xì)胞質(zhì)成分，其中乳雙歧桿菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，見表2。

表2　益生菌成分作用

2.3益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響三種益生菌的細(xì)胞壁成分處理SW-480細(xì)胞48 h，qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照(0.97±0.3)比較，嗜酸乳桿菌(0.71±0.4)、乳雙歧桿菌(0.53±0.1)與長雙歧桿菌(0.63±0.3)三組的Bcl-2相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

與空白對(duì)照比較，*P < 0.05；**P < 0.01圖1　益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響(48 h)

2.4益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bax表達(dá)的影響三種益生菌的細(xì)胞壁成分處理SW-480細(xì)胞48 h，與空白對(duì)照(0.52±0.11)比較，嗜酸乳桿菌(0.69±0.18)、乳雙歧桿菌(0.81±0.10)與長雙歧桿菌(0.73±0.12)三組的Bax表達(dá)均提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

與空白對(duì)照比較，*P < 0.05圖2　Western blot法檢測(cè)益生菌細(xì)胞壁成分對(duì)SW-480細(xì)胞Bax表達(dá)的影響(48 h)

3　討論

目前用于治療結(jié)腸癌的臨床藥物種類繁多，然而這些藥物都有不同程度的副作用[9]。因此，研發(fā)新型的結(jié)腸癌靶向治療藥物是近些年的關(guān)注重點(diǎn)。應(yīng)用細(xì)菌治療腫瘤具有悠久的歷史[10]，但細(xì)菌毒性等因素限制了其研究與臨床應(yīng)用。隨著相關(guān)益生菌研究技術(shù)的提高，為消化系統(tǒng)腫瘤治療的研究提供了新思路[11]。益生菌已被建議作為一種新的預(yù)防和治療結(jié)腸癌的選擇。

益生菌具有改善腸道健康作用，是平衡菌群功能的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，也是一種取代平衡系統(tǒng)中的菌系作用的微生物添加物。研究表明[8]，益生菌有阻礙致病菌在腸道定植，誘導(dǎo)腸道免疫，降低膽固醇，制造營養(yǎng)物質(zhì)，刺激組織發(fā)育等功能，可有效預(yù)防或抑制宿主結(jié)腸癌癥的發(fā)生。益生菌提高人體的免疫機(jī)能、抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制已逐漸引起學(xué)者們的關(guān)注，攝入益生菌L.caseiZhang可通過Claudin15- CLIC4 信號(hào)途徑預(yù)防結(jié)腸癌，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究顯示，攝入保加利亞酸乳可以抑制結(jié)腸癌生長[12]；Jacouton等[13]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌L.caseiBL23可通過上調(diào)caspase-7,caspase-9和Bik等機(jī)制顯著減少氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的結(jié)腸癌小鼠模型中的腫瘤形成，提示該益生菌有望成為抗結(jié)腸癌生物制品。本研究MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長雙歧桿菌可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)濃度依賴性，進(jìn)一步證實(shí)了益生菌可抑制結(jié)腸癌生長。為了解益生菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)抗結(jié)腸癌能力，本研究分離益生菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)分別作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組益生菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)均有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用，并且細(xì)胞壁的抑制作用均大于細(xì)胞質(zhì)。

結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞增殖失控是腫瘤發(fā)生的初始階段。益生菌可通過線粒體途徑調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制增殖。Russo 等[14]研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillusrhamnosus菌株細(xì)胞質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)，顯著抑制人胃癌細(xì)胞HGC-27增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究進(jìn)一步觀察了嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長雙歧桿菌的細(xì)胞壁成分對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平及Bax表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，三種益生菌細(xì)胞壁均可抑制Bcl-2表達(dá)，提高Bax表達(dá)水平，提示嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌與長雙歧桿菌可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌和長雙歧桿菌三種益生菌均可抑制SW-480細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)有關(guān)。