miRNA-155在食管癌中的表達及與其臨床病理特征的關系

聶　龍　周方正　童　琳　潘東風　張東升　王小聰　謝　輝　郭思言

微小RNA(miRNA)是1種能夠參與蛋白的合成以及調控機體細胞活動的小分子非編碼RNA，其長度大約在21～25個核苷酸[1]。據研究報道，miR-155在肺癌[2]，乳腺癌[3]和胰腺癌[4]等多種腫瘤中均存在高表達。但是還未見miR-155在食管癌中表達的相關研究報道。因此本研究通過采用RT-PCR方法檢測miR-155在食管癌組織以及癌旁組織中的表達差異，并分析兩者的表達與食管癌患者臨床病理特征的相關性，進而探討其對食管癌發生，轉移的影響。

1　材料與方法

1.1　一般資料

選取2014年5月至2016年6月本院食管癌手術切除標本及對應的癌旁組織各80例，其中男性52例，女性28例，平均年齡42～76歲，所有患者術前均未接受化療，放療等其他療法，所有組織標本分別于癌旁組織4 cm以內、無壞死癌灶及正常黏膜組織處取材。組織經4%多聚甲醛固定，常規脫水，包埋后連續切片，切片厚度控制在4 μm，進行蘇木精-伊紅染色(HE)染色，經專業病理科老師診斷確診為食管癌。按WHO分類標準(1996)進行組織學分級：高分化34例，中分化25例，低分化21例。淋巴結轉移者38例，無淋巴結轉移者42例。標本采集經本院醫院倫理委員會的審批和認可。

1.2　方法

1.2.1主要試劑Trizol Reagent購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒和cDNA擴增試劑盒均購自MBI Fermentas公司。BioRAD-IQ5 qRT-PCR儀購自美國BioRad公司。

1.2.2RT-PCR檢測組織中miR-155的表達取對數生長期細胞，采用Trizol試劑一步法提取細胞中的RNA，將細胞RNA反轉錄成cDNA,然后擴增成DNA(所有步驟嚴格按照逆轉錄試劑盒和擴增試劑盒說明書操作)。miR-155引物序列：上游：5-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3，下游：5-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3；以GAPDH作為內參，引物序列：上游：5-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3；下游：5-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3。所有引物序列均由上海生物工程技術有限公司合成。RT-PCR反應條件如下：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃變形30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸1 min，40個循環，最后70 ℃延伸10 min結束。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(Bio-Rad,USA)測條帶灰度值。

1.2.3miR-155表達水平的計算方法以目的基因miR-155與內參基因GAPDH灰度值的比值反映miR-155的相對表達量。至少選取3例數據求取平均值。取食管癌患者癌旁正常組織miR-155的表達水平為1，以此為對照，計算食管癌患者癌組織中miR-155的表達水平(以倍數表示)[5]。

1.3　統計學方法

應用SPSS 22.0統計分析軟件對數據進行統計分析。miR-155表達與食管癌患者臨床病理特征之間的關系采用Mann-Whitney檢驗，計量資料用均數±標準差表示，組間的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1　miR-155在食管癌組織與癌旁組織中的表達

RT-PCR結果顯示，食管癌組織中miR-155的表達水平為0.437±0.091，與癌旁組織相比差異具有統計學意義(t=25.184，P=0.007)，見圖1。

2.2　miR-155表達與食管癌臨床病理特征的關系

食管癌組織中miR-155表達與患者性別和年齡無關(P>0.05)；與食管癌組織學分級，腫瘤浸潤深度，淋巴結轉移和TNM分期均有一定的關系(P<0.05),見表1。

1為食管癌組織；2為癌旁組織

表1　miR-155表達與食管癌臨床病理特征的關系

3　討論

Has-miR-155是非編碼基因BIC(B-cell integration cluster，BIC)轉錄所形成。近年的研究更多的聚焦于機體炎癥反應調控以及血液性腫瘤的研究，但是關于miR-155與實體腫瘤的相關性研究少見報道。本研究結果顯示，食管癌患者組織中miR-155的表達水平顯著低于對應的癌旁組織，并且差異具有統計學意義。同時對80例食管癌組織中miR-155的表達水平與患者臨床病理之間的相關性進行分析，結果發現食管癌組織中miR-155的表達與患者的性別和年齡無關(P>0.05)；與患者食管癌的組織學分級，腫瘤的浸潤深度，淋巴結轉移和TNM分期均有一定的關系(P<0.05)。

有研究發現miR-155在肺癌[6]，胃癌[7]和乳腺癌[8]等實體腫瘤中呈現高表達，并且與腫瘤的發生，發展密切相關。同時報道miR-155的高表達與其抑癌作用存在一定的關系。Dorsett等[9]研究發現，高表達的miR-155通過抑制AID(activation-induced cytidine deaminase)產生的潛在癌基因轉位來發揮抗癌的作用。同期研究中也有報道miR-155高表達與促癌作用存在一定的聯系。Ovcharenko等[10]研究發現，高表達的miR-155可以通過抑制凋亡基因caspase-3的表達來抑制腫瘤的凋亡，從而促進腫瘤細胞的生長。Valeri等[11]研究發現在結腸癌患者組織中miR-155的表達水平與錯配修復蛋白MLH1或MSH2表達呈現負相關，結果提示miR-155可以通過調控錯配修復蛋白MLH1或MSH2表達來促進結腸癌腫瘤的發生與發展。Pedersen等[12]在造血細胞增殖機制的研究發現，SHIP1是調節造血細胞增殖與分化的因子，而miR-155可以作用了靶基因SHIP1進而發揮促進細胞生長的作用。Jiang等[13]在乳腺癌細胞中研究發現miR-155可以通過抑制細胞因子信號轉導蛋白1來促進乳腺癌細胞的增殖與生長。

近年的研究也證實，miR-155在炎癥反應和免疫中發揮中重要的作用。miR-155可以通過上調炎性T細胞的活性來促進炎癥反應的發生[14]。Vigorito等[15]研究也發現miR-155在淋巴細胞免疫反應中發揮著關鍵性的作用。另外，miR-155基因敲除的老鼠細胞因子的分泌降低并且T細胞依賴的抗體反應減弱[16]。而炎癥細胞和炎癥反應在腫瘤的發生發展中具有重要作用。因此我們推測食管癌患者組織中miR-155表達的降低可能是導致機體炎癥反應以及抗癌機制的失衡，從而促進腫瘤細胞的生長。

綜上，食管癌患者組織中miR-155的相對表達降低，可能抑制了機體抗癌作用，從而促進食管癌的發生與發展，但是具體的作用機制還需要進一步的研究。