農桿菌介導EuABP2基因遺傳轉化杜仲下胚軸研究

周舒婷 董旋 趙懿琛 趙德剛

摘 要：為提高農桿菌介導的杜仲下胚軸遺傳轉化效率，本研究以杜仲種子為材料，采用正交試驗設計，研究了NAA濃度、種子切割方式及光照強度對杜仲萌發及下胚軸直徑和長度的影響；獲得篩選標記草銨膦用于杜仲遺傳轉化的適宜濃度，并對杜仲抗性芽生根方式進行了優化。結果表明：NAA （0.5 mg/L） ，正中橫切，暗培養15 d，能有效的促進杜仲種子萌發及下胚軸的生長。本試驗條件下杜仲種子萌發率可達95%，下胚軸直徑1.21 mm，長度22.5 mm；以0.25 mg/L的草銨膦能夠對杜仲轉基因抗性芽進行有效篩選；成功獲得轉EuABP2基因表達的杜仲轉基因植株12株。

關鍵詞：杜仲；EuABP2基因；遺傳轉化；下胚軸

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）03-0033-07 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.006

Genetic Transformation of EuABP2 Gene into the Hypocotyl of Eucommia Ulmoides Oliv. [Garryales： Eucommiaceae] via Agrobacterium-mediated Method

ZHOU Shuting1， DONG Xuan1， 2，ZHAO Yichen1， 2*， ZHAO Degang1， 3

（1.The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/ Guizhou Key Lab of Agro-Bioengineering， Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China； 2.The 2011 Collaboration Innovation Center for Mountain Ecology and Agro-Bioengineering in Guizhou Province， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China；3.Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China）

Abstract：To improve the efficiency of genetic transformation of Eucommia ulmoides hypocotyl via Agrobacterium-mediated method， we used Eucommia ulmoides seed as the research material to systematically investigate the influence of NAA concentration， seed cutting mode and light intensity on germination and hypocotyl diameter and length. Appropriate concentration of glufosinate for the genetic transformation of Eucommia ulmoides was obtained. Rooting method of Eucommia ulmoides resistant roots was optimized. The results showed that NAA （0.5 mg/L）， mid cut and dark culture for 15 days could effectively promote the germination and hypocotyl growth of Eucommia ulmoides seed. Under these conditions， the seed germination rate was up to 95%， the diameter of hypocotyl reached 1.21 mm and its length was up to 2.25 cm. Glufosinate at 0.25 mg/L could effectively screen the transgenic resistant buds of Eucommia ulmoides. In addition， by keeping partial hypocotyl and promoting rooting， Twelve EuABP2 gene-expressed Eucommia ulmoides plants were successfully obtained.

Key words：Eucommia ulmoides olive； EuABP2 gene； genetic transformation； hypocotyl

杜仲 （Eucommia ulmoides Oliv.） 又名膠木[1]，為杜仲科杜仲屬落葉喬木，原產于中國，為我國特有的第三紀孑遺植物種[2]，杜仲不僅是我國特有的傳統名貴中藥材[3]，也是重要的含膠植物，在中國的分布以秦嶺以南各省為主，主要分布于云南、貴州等地[4]。近年來對杜仲的研究主要集中在化學成分分離，而分子生物學研究尤其是功能基因的分離與應用報道較少。研究植物功能基因的重要途徑是利用轉基因技術進行功能驗證。研究表明，木本植物轉基因研究的最佳外植體應是下胚軸[5-6]。作為木本植物之一的杜仲，種子發芽率不高，獲得優良下胚軸往往比較困難[7]。已有研究報道種子的萌發及下胚軸生長與生長素濃度[8-9]、種子切口方式[10-11]及光照條件[12]有關。目前，已有一些對杜仲再生和遺傳轉化體系的研究報道，左春芬等人[13]最早涉及這方面的研究，他們用杜仲幼嫩樹枝為外植體誘導出愈傷組織，但未能獲得再生植株。1994年，夏啟中、宋太偉等[14]以杜仲實生苗莖尖為外植體，獲得了完整的再生植株。朱登云等[15]以杜仲成熟干胚乳、葉片、葉柄誘導愈傷組織并再生植株，誘導效率在13%以上；王東良等[16]以1/3MS附加0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA誘導生根，生根率為18%；李巖等[17]在含有0.1 mg/L NAA+0.8 mg/L 6-BA的MS培養基中直接誘導杜仲胚軸產生不定芽，誘導率達到47%，趙丹等[18]采用農桿菌介導法，以杜仲下胚軸為轉化受體對杜仲進行遺傳轉化，研究了卡那霉素濃度、預培養時間、菌液濃度及侵染時間、乙酰丁香酮濃度、共培養時間等對杜仲遺傳轉化效率的影響，成功獲得了轉基因杜仲植株，陽性植株獲得率可達45%；Chen等[19]對杜仲無菌苗進行懸浮培養，以杜仲下胚軸為轉化受體，超聲處理后采用農桿菌介導法對杜仲進行遺傳轉化并改進了培養基配方。

為了建立一種杜仲遺傳轉化效率高、穩定性好、通用性強的外源基因導入的遺傳轉化技術[20-22]，用于目標基因的功能驗證和基因工程改良杜仲，本研究以培育優良杜仲下胚軸為目標，通過分析NAA濃度、種子切口方式及光照強度對萌發杜仲下胚軸及下胚軸直徑和長度的影響，以便優化和確定獲得優良杜仲下胚軸萌發及生長的最適條件，并構建了Act1啟動子驅動杜仲EuABP2表達的植物表達載體，遺傳轉化杜仲下胚軸，以草銨膦濃度進行篩選，確定優化的遺傳轉化條件，為杜仲遺傳改良及杜仲基因的功能鑒定奠定技術基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本試驗所用杜仲種子取自貴州大學轉基因植物試驗示范基地杜仲植株。質粒載體、菌株和PCR檢測引物均由貴州大學農業生物工程研究院保存。遺傳轉化所用根癌農桿菌菌株為LBA4404，構建的pGM626-Act1-EuABP2載體包含由UBi啟動的Bar：：GUS篩選標記以及由Act1啟動的EuABP2，目的基因由NOS終止 （圖1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工程菌制備及PCR檢測

將含有表達載體pGM626-Act1-EuABP2的質粒通過凍融法[23]轉化農桿菌株LBA4404以制備工程菌株。取-80℃保存的LBA4404感受態細胞置于冰中解凍10 min；向每支感受態細胞中加入5 μL質粒DNA，輕輕彈動混勻后冰浴30 min；液氮速凍5 min后，立即37℃水浴2 min；加入900 μL 37℃預熱YEP液體培養基，28℃，200rpm振蕩培養3 h；室溫，4000×g離心1 min后，棄上清；向菌體中加入100 μL YEP液體培養基，用槍頭吸打使之混勻；取適量菌液涂布于含有100 mg/L Kan和20 mg/L Rif的YEP平板培養基上，倒置于28℃恒溫培養箱中培養2d，-80℃保存菌液。

1.2.2 杜仲種子萌發及下胚軸生長條件的篩選

1.2.2.1 杜仲種子消毒

收集成熟的杜仲種子；剝掉種子外殼，用清水浸泡12 h；用含表面活性劑的洗手液清洗種子并以自來水沖洗30 min，直至洗手液完全沖洗干凈；超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s，無菌水漂洗1～ 2次后用有效氯為10%的NaClO溶液浸泡20 min，期間用鑷子輕輕攪動，無菌水漂洗4～5次。

1.2.2.2 正交試驗設計

利用正交試驗方法[24]，按SPSS 17.0 正交優化試驗設計，輸入多因素條件，以SPSS軟件分析，自動生成正交試驗組合（見表2）。采用的杜仲種子處理有切割方式 （不切割、單端切割、兩端切割和正中橫切），置不同濃度的NAA （0 mg/L、0.5 mg/L、5 mg/L、50 mg/L） MS培養基、不同光照條件 （光培、暗培） ，杜仲種子處理后在MS培養基上培養15 d，觀察記錄不同處理杜仲種子發芽率和杜仲下胚軸的長度及直徑。由于下胚軸的生長狀況彎曲不定，測其長度時，先用細繩隨下胚軸彎曲擺放來替代其生長趨勢，然后再用直尺來測量細繩的拉直長度，以此得到下胚軸的長度。下胚軸的直徑取最大值與最小值的平均值，下胚軸的最大直徑和最小直徑直接用游標卡尺來進行精確測量。

1.2.3 外植體制備及預處理

將萌發15 d的杜仲幼苗從種子萌發培養基中取出，輕輕洗去附著在幼苗上的培養基，并將幼苗移入懸浮培養液中懸浮培養3 d，然后置于無菌吸水紙上吸干培養液，將無菌苗切成5～8 mm小段，去除莖尖生長點部分。將切好的杜仲外植體放入重懸液中，超聲處理20 min后以備轉化。

1.2.4 草銨膦抗性濃度篩選

切取未經農桿菌侵染的杜仲15 d苗齡無菌苗下胚軸20個，分別接種于MS含0 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L Bar的篩選培養基上，30 d時觀察并統計下胚軸上生長的不定芽數。

不定芽誘導率=（生長出不定芽的下胚軸數÷接種的下胚軸數）×100%。

1.2.5 菌種活化及預處理

取-80℃保存的含有pGM626-Act1-EuABP2植物表達載體的LBA4404菌株，涂平板接種于含100 mg/L Kan 和20mg/L Rif的YEP固體培養基上，28℃下倒置暗培2 d，待菌落長出，挑取陽性單菌落接種于5 mL含100 mg/L Kan 和20 mg/L Rif的YEP液體培養基中，28℃搖床上200 r/min振蕩活化培養16～20 h，取50～100 μL菌液接種于相同的YEP液體培養基中，繼續培養至OD600值為0.5～0.6，5000 g 4℃離心10 min，棄上清，用重懸液重懸菌體至OD600值為0.25～0.3，在菌體重懸液中加入10 μL表面活性劑備用。

1.2.6 農桿菌介導杜仲遺傳轉化

將超聲處理20 min后的杜仲外植體置于菌體重懸液中侵染，侵染時間3 min。取出侵染結束的杜仲外植體置于無菌紙上吸干菌液，緊密排布于共培培養基上，28℃暗培3 d后轉移到篩選培養基上培養，每15 d換一次篩選培養基。將分化出抗性芽的杜仲外植體從中間部位切斷，保留部分下胚軸以促進生根，將外植體上未產生不定芽的一段插入培養基中培養，每15 d換一次生根培養基，統計陽性植株獲得率及不定芽的生根率。

陽性植株獲得率=（陽性植株數÷獲得的植株數）×100%。

生根率=（生根的不定芽數÷接種的不定芽數）×100%。

1.2.7 GUS基因組織染色的檢測

將篩選出杜仲抗性芽葉片置于GUS組織化學染色液中侵泡，抽真空10 min，37℃溫育6 h，然后使用75%和95%的乙醇脫色12 h，觀察、鏡檢并照相。

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft office Excel 2003及SPSS 17軟件進行處理和分析，多重比較采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 工程菌的PCR鑒定

提取經Kan篩選獲得的陽性農桿菌單菌落DNA，進行PCR后電泳觀察，結果表明，所選擇的陽性菌株中含有與目的基因大小一致的擴增片段，可認為質粒pGM626-Act1-EuABP2已經成功轉化所選擇的陽性農桿菌菌株。

2.2 各因素對杜仲種子萌發及下胚軸生長的影響

通過正交試驗結果（表3）的極差分析表明，NAA處理濃度的R值（極差，數值越大證明對結果影響越大）最大，為1.388，切割方式的R值最小，為0.228（表4），說明NAA濃度對杜仲種子下胚軸長度生長影響最大，其次為光照條件，而切割方式影響最小。方差分析表明，NAA濃度和光照條件對杜仲種子下胚軸長度的影響達顯著水平，而切割方式對其影響不顯著（表5）。

對各因素不同水平條件下的杜仲種子萌發率及幼苗生長狀況研究表明，未經切割的第3、8、12組的杜仲種子萌發率只有30%左右，分別為35%、30%和25%。第16組未經切割但在濃度為0.50 mg/L的NAA促進作用下，種子萌發率達到58%，而其余經過切割的杜仲種子萌發率均高于不切割時種子的萌發率，正中橫切時種子萌發率最高可達95%，最低為60%；單端切割時種子萌發率最高可達95%，最低為52%；兩端切割時種子萌發率最高可達94%，最低為51%。NAA濃度為0.5 mg/L時，采用正中橫切，杜仲下胚軸長度最大。不切割和正中切割，NAA濃度在0～0.5 mg/L之間時，下胚軸長度隨NAA濃度增大而增大。采用單端切割或兩端切割，NAA對下胚軸生長起抑制作用。在NAA濃度為5 mg/L時，不切割和兩端切割的處理中杜仲直徑最大。NAA濃度為0～5 mg/L時，對杜仲下胚軸徑粗生長起促進作用；NAA濃度大于5 mg/L則抑制徑粗生長。本試驗條件下，光照對根生長的影響不顯著。因而，最適宜杜仲下胚軸生長的條件為：NAA濃度0.5 mg/L ，正中橫切，暗培養15 d，種子萌發率達到95%，下胚軸直徑可達1.21 mm，長度可達22.5 mm。

2.3 Bar最適宜抑制濃度篩選

對30 d后不同濃度Bar篩選培養基上接種的未經農桿菌侵染的杜仲15 d苗齡無菌苗下胚軸生長狀況統計進行，結果顯示：Bar濃度為0 mg/L時，不定芽誘導率為83%；Bar濃度為0.25 mg/L時，不定芽誘導率為37%；Bar濃度為0.50 mg/L時，不定芽誘導率為12%；Bar濃度為1.00 mg/L時，不定芽誘導率為0%。當Bar濃度為0.25 mg/L時，杜仲無菌苗下胚軸不定芽誘導率為37%明顯受抑制，為平衡不定芽誘導率及篩選效率，選Bar濃度為0.25 mg/L為篩選濃度（表8）。在對篩選標記草銨膦的篩選濃度進行選擇時，本研究選擇了對杜仲分化有顯著抑制但又不完全抑制的濃度 （0.25 mg/L） ，濃度過高會造成杜仲不定芽誘導率極低，濃度過低則無法滿足篩選效率，當篩選標記草銨膦的篩選濃度為0.25 mg/L時，既能得到較高的杜仲不定芽誘導率，又能起到一定的篩選作用，而未被篩選掉的抗性芽會通過GUS組織染色進一步篩選。

2.4 杜仲下胚軸轉化效率分析

通過本實驗的方法遺傳轉化杜仲后得到14株杜仲轉基因植株，GUS組織染色初步檢測獲得12株陽性植株，陽性植株獲得率可達85.7%。通過采取保留部分下胚軸以促進生根的方式成功誘導7株不定芽生根，生根率可達58.3%。杜仲下胚軸遺傳轉化過程及GUS染色情況見圖4。

3 結論與討論

外源基因導入的遺傳轉化技術是目標基因的功能驗證和基因工程改良育種的重要步驟，由于木本植物和草本植物在生長發育條件、器官部位等方面有相當大的差異，尤其是木本植物中較多的多酚類物質會阻礙細胞分裂和生長，導致木本植物組織培養再生體系的建立十分困難，而杜仲作為一種木本植物其再生體系，以及遺傳轉化體系的建立一直以來都是研究的難點。在前期實驗中我們發現杜仲種子萌發率低，且不易獲得滿足遺傳轉化條件的下胚軸，而下胚軸萌發情況是影響轉化效率的關鍵因素之一。本研究通過對光照條件，生長素濃度及種子切割方式的種子萌發條件的優化，使杜仲種子萌發率達到95%，獲得大量適用于遺傳轉化的下胚軸，大大降低了杜仲遺傳轉化中的工作量。在以優質的杜仲下胚軸為遺傳轉化的材料，基于趙丹、Chen的研究結果進行遺傳轉化，陽性植株獲得率較本實驗室前期顯著提高，由45%提高到85.7%。通過保留部分下胚軸以促進生根的方式顯著提高了不定芽的存活率，成功誘導不定芽生根，生根率可達58.3%，本實驗的研究工作為杜仲下胚軸遺傳轉化提供了技術支持，為杜仲功能基因的研究奠定了基礎。

參 考 文 獻：

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