轉CmTre1基因RNA干擾水稻的室內和田間抗蟲性鑒定

夏浪 杜娟 李尚偉 趙鳳

摘 要：稻縱卷葉螟是一種主要的水稻害蟲，海藻糖酶是昆蟲幾丁質合成通路上的關鍵酶之一。該研究對轉稻縱卷葉螟可溶性海藻糖酶基因（CmTre1）雙鏈RNA（dsRNA）水稻進行了室內和田間抗蟲性鑒定。葉片測定結果表明，取食轉CmTre1基因dsRNA水稻株系608的稻縱卷葉螟死亡率為70.00%，校正死亡率為50.95%。定量PCR檢測表明，幼蟲取食608株系后其體內CmTre1基因的mRNA水平下降59.00%，該基因的表達被抑制。田間抗蟲性檢測結果表明，608株系的卷葉率為15.06%，白葉率為13.98%，與對照差異顯著。轉CmTre1基因RNA干擾（RNAi）水稻對稻縱卷葉螟具有抗性。該研究為利用RNAi技術對稻縱卷葉螟進行綠色防控奠定基礎。

關鍵詞：稻縱卷葉螟；海藻糖酶；RNA干擾；抗蟲性

中圖分類號：Q966

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）03-0074-05 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.013

Indoor and Field Identification of Insect Resistant of CmTre1-transgenic RNAi Rice

XIA Lang，DU Juan， LI Shangwei*， ZHAO Feng

（Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region， Institute of Entomology， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550002 China）

Abstract：：The rice leaf folder， Cnaphalocrocis medinalis， is a major rice pest. Trehalase （Tre） is one of the key enzymes in the chitin synthesis pathway of insects. In this study， we identified the insect resistance of rice that was introduced the double-stranded RNA （dsRNA） of soluble trahalase gene from C. medinalis （CmTre1） indoors and in the fields. Results of leaf assay showed that mortality rate of C. medinalis fed on the dsRNA-transgenic rice line 608 was 70.00% and the corrected mortality rate was 50.95%. Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） analysis demonstrated that mRNA level of CmTre1 in C. medinalis fed on rice 608 dropped by 69.00%， and the expression of CmTre1 gene was inhibited. Results of insect resistance test in the fields indicated that the average rate of rolled and white leaves for rice 608 was 15.06% and 13.98%， respectively， which was significantly different from the control. The CmTre1 dsRNA-transgenic rice was resistant to C. medinalis. This study would lay the foundation for the green control of C. medinalis using RNA interference （RNAi） technology.

Key words：Cnaphalocrocis medinalis； trehalase； RNA interference； insect resistance

稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）是水稻的主要害蟲之一，對該害蟲的有效防治是保證糧食安全生產的重要問題。目前，在稻縱卷葉螟防治工作中仍以化學殺蟲劑為主要手段，然而長期大量使用化學農藥會造成一系列問題，如環(huán)境污染、對非靶標生物有負面影響以及害蟲產生抗藥性等[1]。因此，人們急需尋找一種新型殺蟲方法來防治稻縱卷葉螟。

海藻糖是昆蟲血淋巴中主要的糖類物質，海藻糖酶可將一分子海藻糖分解為兩分子葡萄糖。昆蟲海藻糖酶根據(jù)是否存在跨膜結構，可分為兩類：可溶性海藻糖酶（soluble trehalase，Tre1）與膜結合型海藻糖酶（membrane-bound trehalase，Tre2）[2]。可溶性海藻糖酶分解細胞內海藻糖，而膜結合型海藻糖酶分解胞外（主要為食物中）海藻糖[3]。第一個可溶性海藻糖酶基因于1992年從黃粉蟲（Tenebrio molitor）中被克隆[4]，主要在中腸、馬氏管和卵巢中表達。膜結合型海藻糖酶基因，直到2005年才從家蠶（Bombyx mori）中獲得[5]，主要在脂肪體、中腸和馬氏管中表達。研究表明，多數(shù)昆蟲體內都存在一個膜結合型和一個可溶性海藻糖酶基因，僅少數(shù)昆蟲如異色瓢蟲（Harmonia axyridis）[6]和褐飛虱（Nilaparvata lugens）[7]中找到多種可溶性海藻糖酶基因。海藻糖酶在昆蟲幾丁質合成與能量代謝過程當中扮演著十分重要的角色。因此，越來越多的科研工作者把海藻糖酶作為害蟲防治的一個理想靶標。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的轉錄后基因沉默機制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[8]，具有特異性和高效性。RNAi技術可被用于探索基因功能、腫瘤治療及生物防治等方面。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)昆蟲都具有系統(tǒng)性RNAi，對某些昆蟲如赤擬谷盜（Tribolium castaeum）和蟋蟀（Gryllus bimaculatus）的親本實施RNAi，在其子代中仍可觀察到基因沉默現(xiàn)象[9-10]。

本實驗室通過轉基因技術將稻縱卷葉螟可溶性海藻糖酶基因CmTre1的雙鏈RNA （ds RNA）導入到水稻中，培育了轉CmTre1基因RNAi水稻。本研究是以這些水稻株系為研究對象，在室內和田間鑒定其抗蟲性，以期為利用RNAi技術對稻縱卷葉螟進行綠色防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與水稻

供試水稻材料為轉CmTre1基因dsRNA的中花11。供試昆蟲為稻縱卷葉螟幼蟲，飼養(yǎng)條件為 26±1℃，相對濕度70%～80%，光周期14L∶10D。

1.2 主要試劑與儀器

HP Total RNA Kit購自美國 Omega Bio-tek 公司；大腸桿菌Escherichia coli TOP10感受態(tài)細胞、DL2000 DNA marker、PrimeScript RT-PCR Kit 、LA Taq DNA聚合酶均購于大連 TaKaRa公司；PCR儀（C1000 Thermal Cycler）和iTaq Universal SYBR Green Supermix 采購于美國 Bio-Rad 公司；離心管、PCR耗材及其他常規(guī)試劑與耗材均購自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

取稻縱卷葉螟3齡幼蟲50～100 mg，液氮研磨后，用HP Total RNA Kit（Omega）提取總RNA，具體過程按照說明書進行操作，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分別檢測總RNA的完整性和純度。按照 采用PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa）試劑盒將提取的總RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.4 熒光定量PCR引物設計

利用 Primer 6.0 針對稻縱卷葉螟CmTre1基因的編碼區(qū)設計熒光定量 PCR （RT-qPCR）引物 CmTre1q-F 和 CmTre1q-R（表 1），檢測RNAi后稻縱卷葉螟體內CmTre1的mRNA表達水平。以稻縱卷葉螟看家基因CmActin（GenBank登錄號：JN029806）為內參對照。

1.5 室內抗蟲性檢測

用葉片測定法進行RNAi水稻的室內抗蟲性鑒定。將直管（12 cm × 3 cm）一端用包裹有棉花的細紗布封口，分別剪取3個轉CmTre1基因dsRNA水稻株系（605、608和622）的 5 片葉放入不同的直管中。每管接15頭稻縱卷葉螟3齡幼蟲，每隔 12 h，觀察記錄幼蟲取食、表型及存活情況。每天定時在直管兩端噴灑保鮮液，3 d更換一次葉片，7 d后統(tǒng)計死亡率，用存活的幼蟲進行RT-qPCR檢測。 死亡率計算公式：死亡率=死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù)；校正死亡率計算公式：校正死亡率=（實驗組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）。設3次重復，以正常水稻葉作為對照。

1.6 CmTre1基因沉默效應檢測

稻縱卷葉螟取食轉 CmTre1 基因dsRNA水稻葉片7 d后，分別收集實驗組和對照組各2頭存活的幼蟲，提取總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA，然后以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。PCR反應體系：1 μL cDNA，20 μmol/L上/下游引物各0.5 μL，10 μL 2× iTaq universal SYBR Green supermix （Bio-Rad），補加滅菌水到總體積20 μL。反應參數(shù)：95℃預變性1 min；95℃變性10 s，55℃ 退火20 s，72℃延伸30 s，進行40個循環(huán)。采用CFX Manager軟件（Bio-Rad）進行實驗數(shù)據(jù)記錄與分析。

1.7 田間抗蟲性檢測

將轉CmTre1基因dsRNA水稻株系以小區(qū)塊種植，選35株罩上尼龍網(wǎng)，至分蘗盛期在每個網(wǎng)中的水稻上人工接種50頭稻縱卷葉螟低齡幼蟲，每隔7 d觀察一次，30 d后統(tǒng)計水稻的卷葉率和白葉率。平均每株卷葉率=卷葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/35；平均每株白葉率=白葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/35。每個處理重復3次，以正常水稻作為對照。

1.8 數(shù)據(jù)與分析

采用 2-ΔΔCt法分析稻縱卷葉螟取食轉CmTre1基因dsRNA水稻葉片后，其體內CmTre1基因的mRNA相對表達量。結果以平均值±標準差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制柱形圖。采用SPSS 22統(tǒng)計軟件中方差分析（ANOVA）的Duncan氏新復極差法進行多重比較檢驗，顯著性檢驗水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 取食情況及表型觀察

在接蟲 2 d和 4 d后，觀察稻縱卷葉螟的活力，通過其對水稻的取食情況判斷其生命活力強度。用轉CmTre1基因dsRNA水稻葉片飼喂稻縱卷葉螟 2 d后，可以清楚地看到，實驗組和對照組的水稻葉片沒有明顯的差別，表明稻縱卷葉螟活力差不多；飼喂 4 d后，對照組水稻葉片被取食十分嚴重，而實驗組水稻葉片并沒有明顯的變化（圖1），說明稻縱卷葉螟在取食了RNAi水稻葉片后其生命活力明顯受到抑制。接蟲 7 d后，有的蟲體變黃，活動緩慢，部分蟲體畸形發(fā)育，有的還出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；不能正常化蛹，有些在化蛹期間死亡，只有極少部分能化蛹，但是蛹比較小，活力較低（圖2）。

2.2 室內抗蟲性鑒定

在直管中接蟲7 d后，取食轉CmTre1基因dsRNA水稻株系605、608和622的稻縱卷葉螟死亡率分別為60.00%、70.00%和66.67%，校正死亡率分別為 31.27%、50.95% 和43.49%，與對照組（701）相比差異顯著（表2）。結果表明，轉CmTre1基因dsRNA水稻對稻縱卷葉螟具有致死效應，株系608具有較好的抗蟲效果。

2.3 CmTre1基因mRNA表達水平

實時熒光定量PCR結果顯示，稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲取食轉 CmTre1 基因dsRNA水稻葉片7 d 后，其體內可溶性海藻糖酶基因的表達水平相比對照組明顯下降；取食605、608和622后，該基因的mRNA表達水平分別下降了55.00%、59.00%和48.00%，與對照組差異顯著（圖3）。

2.4 田間抗蟲性鑒定

在田間人工接蟲 30 d后，轉CmTre1基因dsRNA水稻株系605、608和622的卷葉率分別為 12.20%、15.06%和14.81%，相較于對照，分別減少了11.50%、8.64%和8.89%；白葉率分別為11.43%、13.98%和13.20%，相對于對照，分別減少了11.22%、8.67%和9.45% （表3）。田間與室內抗蟲性鑒定結果基本一致，稻縱卷葉螟幼蟲選擇性拒食RNAi水稻，利用RNAi技術防治稻縱卷葉螟具有一定的效果。

3 結論與討論

海藻糖酶是昆蟲能量代謝中的一類酶，也是昆蟲幾丁質合成通路中的第一個酶，它參與昆蟲生長發(fā)育、蛻皮及繁殖等許多重要生理過程[12-13]。可溶型海藻糖基因對昆蟲表皮幾丁質合成影響更大，而膜結合型海藻糖酶基因影響中腸幾丁質的合成[14-15]。在褐飛虱中，TRE的dsRNA能夠有效地抑制海藻糖酶基因mRNA的表達，影響幾丁質的合成與降解，從而導致幾丁質含量下降、蛻皮困難及死亡[16，17]。在東亞飛蝗中，LmTre-1的mRNA 表達特性與幾丁質合成酶1 基因非常相似，結果表明該基因可能與體壁幾丁質的合成相關[18]。本研究對轉CmTre1基因dsRNA水稻進行了室內和田間的抗蟲性鑒定，從總體來看，株系608的抗蟲性較好一些。該株系僅僅是導入了CmTre1基因dsRNA，下一步我們計劃在水稻中同時導入稻縱卷葉螟2個海藻糖酶基因和2個幾丁質合成酶基因的dsRNA，以期當該害蟲取食這些轉基因RNAi水稻時其體內這2類基因都被沉默，實現(xiàn)對該害蟲的生物防治。

目前，利用植物介導的RNAi技術，讓昆蟲取食植物中表達的來自昆蟲重要功能基因的dsRNA來實現(xiàn)對昆蟲重要基因沉默方面的研究越來越多。Baum等[19]通過植物介導的昆蟲腸道特異基因的RNAi技術成功獲得了對根螢葉甲（Diabrotica virgifera）有抗性作用的轉基因抗蟲性玉米，這種方法很大程度上推動了轉基因RNAi作物抗蟲的研究進展。Mao等[20]利用轉基因技術在煙草和擬南芥中表達了靶向棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）細胞色素P450基因CYP6AE14的dsRNA，當棉鈴蟲進食轉基因植物后，CYP6AE14的表達水平顯著下調，幼蟲生長發(fā)育受阻。Zha等[21]將褐飛虱（Nilaparvata lugens） 中腸里高表達的3個基因NlHT1、Nlcar 和Nltry 轉入到水稻中，在水稻中表達它們的dsRNA，褐飛虱取食后，這3個基因均有效地被沉默。這些研究結果表明，我們可以應用轉基因RNAi技術沉默害蟲重要功能基因，培育抗蟲作物新品種，實現(xiàn)對害蟲的綠色防控。

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