哮喘、慢性阻塞性肺疾病、ACOS患者氣道重塑及氣道上皮屏障的對比

郭偉洪 張丹丹 繆卓峰 梁劍平 袁小玲

廣東省中山市人民醫院呼吸內科，廣東中山 528400

2014年全球慢性阻塞性肺疾病防治創議（GOLD）及哮喘防治創議（GINA）首次對哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊綜合征（ACOS）的臨床特征進行全面綜述，并對其診斷及治療提出建議[1-2]。但目前在臨床上識別及明確診斷ACOS仍有一定的難度。近年來關于其流行病學、病因、臨床特征、病理生理特征、治療方案等研究全面開展[3]。但尚未見到關于ACOS患者氣道重塑及氣道上皮屏障功能等方面的研究。

氣道重塑在氣道慢性炎癥性疾病發展中起關鍵作用，可導致氣道反應性增高、肺功能下降、激素抵抗、病情加劇及造成不可逆氣流受限[4]。既往研究發現，哮喘及COPD患者均存在氣道重塑，但兩者氣道重塑發生的部位、程度及具體結構變異卻不完全一致[5]。氣道上皮屏障功能主要由氣道上皮細胞、上皮細胞間連接蛋白及上皮細胞與基質間連接組成。其功能的破壞直接導致氣道炎癥的發生。但目前尚未有關于ACOS及COPD患者氣道屏障功能的報道[6-7]。

本研究擬通過對比哮喘、COPD及ACOS患者氣道黏膜基底膜厚度、上皮細胞間E鈣粘蛋白及B-環連蛋白的分布，初步研究三種疾病狀態下氣道重塑情況及氣道上皮屏障功能，從病理角度識別三種疾病的異同，為更好的認識及區分三種疾病提供進一步依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年3月 ～ 2016年3月中山市人民醫院呼吸科就診的正常組15例、哮喘14例、慢阻肺16例及重疊綜合征14例 。ACOS診斷參考2014年GINA及GOLD聯合推薦指南[8]，慢阻肺及哮喘的診斷按照2014年版GOLD和GINA指南標準[9]。正常組的納入標準：（1）來院進行健康體檢的志愿者；（2）年齡＞20歲；（3）檢查資料齊全。其他三組的納入標準：（1）所有患者均處于疾病穩定期；（2）3個月內未使用吸入及全身激素；（3）近4周無急性呼吸道感染；（4）所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

免疫組化試劑盒（購自深圳的晶美工程公司）、兔抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人B-catenin多克隆抗體、抗兔二抗（均購自武漢的博士德生物公司）、肺功能儀（購自日本美能公司的AS-407型）、光學顯微鏡（購自日本奧林巴斯公司的CX23型）等。

1.3 研究方法

1.3.1 基本資料采集 收集所有受試者的一般資料，包括年齡、吸煙史、過敏史、近6個月用藥史及行mMRC、CAT等問卷調查。

1.3.2 肺功能檢查及分組 所有患者完善肺通氣功能、支氣管激發實驗或支氣管舒張實驗檢查。主要檢查指標：FEV1，FVC、FEV1%預計值。

1.3.3 纖維支氣管鏡檢查下氣道黏膜活檢 所有患者在氣道局部麻醉或聯合全身麻醉狀態下行纖維支氣管鏡檢查。在段級支氣管開口附近取3 ～ 5塊氣道黏膜。標本迅速放入4%福爾馬林中固定，后期行HE染色及免疫組化檢測。

1.3.4 基底膜厚度的測量 固定好的氣道黏膜組織，經脫水、包埋、切片、中性樹膠封片后，置光學顯微鏡下觀察，采用image J（NIH，美國）軟件進行基底膜厚度測量。每個標本至少測量3個不同位置基底膜厚度，最終取平均值。測量方法參考Justyna的方法。

1.3.5 免疫組化 氣道粘膜組織行福爾馬林固定、脫水、包埋、切片、脫蠟、水化。3%H2O2封閉15min，兔抗人E-cadherin多克隆抗體（1∶100）4℃孵化過夜。抗兔二抗37℃孵化60min，DAB顯色。蘇木素復染1min，脫水、封片，倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.4 統計學分析

采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量資料作正態性檢驗，如樣本符合正態分布以（±s）表示；如樣本不符合正態分布則以中位數（四分位數間距）表示；計數資料用例數（%）表示。兩組治療前基線的比較采用兩個獨立樣本t檢驗或χ2檢驗方法，多組間比較采用one-way ANOVA，各組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者一般情況

健康對照組、哮喘組、慢阻肺組、ACOS組各組間性別、年齡、吸煙史差異無統計學意義（P＞0.05）。但各組間肺功能（FEV1、FEV1/FVC）差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表 1。

2.2 各組氣道基底膜厚度比較

哮 喘 組（47.25±14.38）μm 及 ACOS組（54.75±18.28）μm氣道基底膜厚度較正常組（12.25±3.86）μm明顯增厚（P＜0.05）。COPD組（23±7.87）μm與正常組無顯著差異（P＞0.05）。與COPD組相比，ACOS組基底膜厚度明顯增厚，且差異有統計學意義（P＜0.05）；與哮喘組相比，ACOS組基底膜厚度有增加，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 1 ～ 2。

表1 各組間一般資料

圖1 各組患者氣道黏膜基底膜厚度注：光學顯微鏡×400倍

圖2 各組氣道黏膜基底膜厚度比較（±s）

2.3 氣道上皮細胞間連接蛋白表達及分布的異同

各組中，E-鈣粘蛋白 及β-環連蛋白均主要表達于氣道上皮細胞膜，胞質中也有表達，其中β-catenin亦可見胞核表達。相對于正常組，哮喘組、COPD組及ACOS組E鈣粘蛋白細胞膜上的分布減少、排列紊亂，但各組間差異不明顯（圖3）。各組間β環連蛋白表達無明顯差異（圖4）。

圖3 各組氣道黏膜E鈣粘蛋白免疫組化

圖4 各組氣道黏膜β環連蛋白免疫組化

3 討論

哮喘及COPD均屬于慢性氣道炎性疾病，可累及從中央到外周的整個呼吸道[10]。ACOS作為獨立于哮喘及COPD的一種疾病，具有自身的特點。本研究從氣道基底膜厚度及氣道上皮間連接蛋白的分布入手，從病理特征上進一步認識三種疾病的異同。

本研究發現，與哮喘及COPD患者相比，ACOS患者氣道基底膜增厚最明顯，提示ACOS患者氣道重塑程度最重。這一發現從另一個角度解釋了ACOS患者肺功能更差、FEV1下降速度更快、臨床癥狀更重的原因。目前普遍認為，ACOS患者是在患有哮喘基礎上進展為COPD，或者在不完全可逆氣流阻塞情況下出現部分可逆性氣流受限，病人在氣道炎癥方面更類似于COPD[11-12]。而本實驗發現ACOS患者氣道基底膜厚度與asthma更類似，COPD患者氣道基底膜增厚相對較輕。提示在氣道重塑方面，ACOS可能與asthma程度更接近。但有關三種疾病狀態下氣道重塑的具體差異，尚需更進一步的研究證實。

本研究發現ACOS患者BMT厚度較COPD組明顯增厚，可以解釋為何臨床上ACOS患者對糖皮質激素治療反應較COPD好。該發現為ACOS患者早期使用表面激素治療提供了進一步的理論依據。E鈣粘蛋白及β-環連蛋白是組成氣道上皮細胞間粘附連接及緊密連接的重要分子，參與氣道上皮機械屏障及炎癥防御功能。既往研究發現哮喘患者中存在E鈣粘蛋白、ZO-1等連接蛋白表達異常，且與氣道炎癥程度有一定相關性[13-14]。本研究發現asthma、COPD及ACOS各組中E鈣粘蛋白表達均存在有分布紊亂及表達減少，首次證實了COPD及ACOS患者同樣存在有類似哮喘患者的上皮屏障功能的破壞。該研究結果提示屏障功能的破壞可能是慢性氣道炎性疾病的共同特征。本研究未發現三組間E鈣粘蛋白分布及表達存在顯著差異，不排除與病例數較少有關；且受研究條件限制，未同時行誘導痰及肺泡灌洗液檢查，未能進一步研究上皮屏障功能的破壞與炎癥浸潤的關系。本研究中，各組間上皮細胞β環連蛋白表達無顯著差異，但其在細胞內的分布可能存在不同，在哮喘組存在細胞核分布增多及分布較彌散的情況，具體的差異尚需進一步的研究來證實。

總之，asthma、COPD、ACOS患者間氣道基底膜厚度存在明顯差異，提示ACOS組氣道重塑程度最重；各組間E鈣粘蛋白表達及分布較正常組均有異常。本研究為進一步的認識ACOS及區別ACOS與asthma及COPD提供了新的途徑。但仍需大樣本的研究及更加深入的分子機制來探討三種疾病致病機制的異同。