HOXD3在乳腺癌細胞干性和化療耐藥性中的作用及機制研究*

乳腺癌是影響全球女性健康最常見的癌癥，全球女性乳腺癌發病率和死亡率分別占女性癌癥的25%和15%［1］。雖然隨著診療水平的提高，其發病率和死亡率均有所改善，但腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）的存在及耐藥性的發生仍給治療帶來巨大難度［2］。對于復發性乳腺癌，耐藥幾乎不可避免，因此了解腫瘤耐藥的分子機制尤為重要。本研究旨在通過探討同源盒基因HOXD3表達對乳腺癌細胞惡性生物學行為及耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集2006年1月至2008年12月于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院行乳房切除術且病理確診乳腺癌的組織標本87例。組織標本收集后在液氮中冷凍，并儲存于-80℃用于分析。

1.1.2 主要試劑 兔抗人多克隆HOXD3抗體購自美國Santa Cruz公司；兔二抗、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術公司；DMEM培養基、PBS均購自美國Gibco公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；Li?pofectamine2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學方法 使用常規免疫組織化學方法檢測乳腺癌組織中HOXD3表達。組織蠟塊4 μm切片附于載玻片上，經二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，于檸檬酸中高溫高壓修復，滴加抗HOXD3抗體，4℃孵育過夜。滴加生物素標記二抗，DAB顯色，蘇木素復染，甘油凝膠封片。

1.2.2 細胞培養、轉染和處理 使用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435。取對數生長期的人乳腺癌細胞，使用無血清DMEM/F12培養基培養7～10天后，光鏡下觀察細胞球，測量、計數、拍照。從MDA-MB-231 mRNA中擴增HOXD3 cDNA，將其克隆至pcDNA3.1載體中，生成HOXD3過表達質粒。Lipofectamine2000根據說明書用于質粒轉染。轉染后使用不同劑量順鉑或阿霉素處理乳腺癌細胞，檢測其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 RT-PCR檢測 使用TRIzol提取總RNA，Takara反轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得總cDNA。分別擴增目的基因和對照內參β-actin，反應條件為預變性95℃15min、94℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s，40個循環，95℃ 15 s、60℃15 s、95℃15 s以驗證PCR產物的特性。采用Sequence Detector System 2.0軟件進行數據分析，計算相關基因的相對表達量，使用引物見表1。

表1 基因及引物序列

1.2.4 Western blot檢測 使用蛋白裂解液在4℃裂解細胞30 min，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量分析。經SDS/PAGE凝膠電泳后轉移至PVDF膜；質量分數5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，分別加入一抗，4℃過夜，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h；洗膜后加ECL試劑，將PVDF膜放入X線暗盒，壓片，顯影，定影。使用GD5800分析系統對條帶進行定量分析。

1.2.5 免疫熒光染色法 細胞在蓋片上生長融合到85%時，從孵箱中取出；PBS洗滌后用4%甲醛固定20 min；5%BSA室溫封閉30 min；加入抗HOXD3抗體于4℃溫育過夜；PBS洗滌后，加二抗室溫孵育30 min；DAPI核染色后封片。

1.2.6 MTT法 收集對數生長期MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞，調整細胞濃度為5×103/mL，取500 μL接種于96孔培養板，分別在第0、1、2、5、6天每孔加入濃度為5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃溫育4 h后移除上清，加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），590 nm波長處測定吸光度值。

1.3 統計學分析

使用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。結果以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析（ANO?VA）進行序列分析，非配對t檢驗進行組間比較。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HOXD3在乳腺癌組織和細胞系中的表達

圖1 87例乳腺癌組織和癌旁正常組織及乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7中HOXD3的mRNA和蛋白表達水平

本研究發現，HOXD3在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435和MCF-7中的蛋白或基因表達水平，均顯著高于癌旁正常組織及正常乳腺上皮細胞系MCF-10A（均P＜0.05，圖1）。提示HOXD3在乳腺癌組織及細胞系中高表達可能對乳腺癌惡性生物學行為的維持起重要作用。

2.2 HOXD3在乳腺癌耐藥細胞系中的表達及對耐藥性的影響

本研究分別建立了對順鉑或阿霉素耐藥的細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435，檢測發現兩種細胞系的IC50分別為（20.82±0.05）μmol/L和（19.69±0.47）μmol/L，或（32.26±0.23）mmol/L和（26.08±0.55）mmol/L，均高于對應原細胞系（均P＜0.05），MDA-MB-231細胞的IC50更高，耐藥倍數分別為2.47和3.10倍，或1.86和2.08倍（圖2A）。采用RT-PCR法及免疫熒光染色法檢測HOXD3在耐藥細胞系中的表達發現，耐藥細胞系中HOXD3的表達水平均明顯高于原始細胞（均P＜0.05，圖2B～D）。使用HOXD3過表達質粒轉染原始MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞發現，HOXD3 mRNA和蛋白表達水平均明顯增高（均P＜0.01，圖3A～B），隨后使用順鉑或阿霉素處理，MTT法和集落形成實驗表明，HOXD3過表達的MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞活力及集落形成能力顯著增加（均P＜0.05，圖3C～F）。

圖2 順鉑或阿霉素耐藥的乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435中HOXD3表達

圖3 乳腺癌耐藥細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435中HOXD3表達及對耐藥性的影響

2.3 HOXD3對乳腺癌細胞干性的影響

本研究發現，MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞中HOXD3表達上調導致腫瘤球體數目顯著增加（均P＜0.05，圖4A），HOXD3過表達的MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞中，乳腺癌干細胞的生物標記物CD133、Nanog、Oct4和SOX2等的表達水平顯著增加（均P＜0.05，圖4B～D），HOXD3表達上調可促進乳腺癌細胞增殖（圖4E）。

圖4 HOXD3對乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞干性的影響

3 討論

既往的研究提示，乳腺癌干細胞是產生化療耐藥，造成乳腺癌復發的根源［3］。本研究結果提示，HOXD3過表達對乳腺癌細胞干性維持及耐藥性的產生發揮重要的作用，HOXD3在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中的基因或蛋白水平顯著高于癌旁正常組織及正常乳腺細胞。HOXD3可促進乳腺癌干細胞標志物的表達上調，并對乳腺癌干細胞自我更新能力的維持起著重要的作用。此外，本研究還證實HOXD3表達可促使乳腺癌細胞產生多重耐藥。CSCs是腫瘤細胞內一小群具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞，大量證據支持CSCs引起化療耐藥的理論，CSCs對常規放化療表現出強烈的抵抗能力，被認為是腫瘤發生、發展、轉移與復發的根源［4-6］。耐藥分為固有耐藥及獲得性耐藥，或兩者兼有。固有耐藥可能與上皮間充質轉換（epithelial mesenchymal tran?sition，EMT）、CSCs自然靜止傾向、DNA修復能力增強，以及ATP-結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運蛋白高表達從而導致藥物外流等因素有關［5］。獲得性耐藥則可能與治療過程中存活的干細胞亞群累積突變，產生耐藥表型有關［7］。CSCs介導化療耐藥的機制尚未完全明確，目前已知多種信號通路Hedge?hog、JAK/STAT3、TGF-β、Wnt/β-catenin等可能在乳腺癌干細胞介導的化療耐藥過程中發揮重要作用［8-10］。

HOX基因家族是一個高度保守的轉錄因子家族，在正常生理發育過程中，HOX基因家族調控所有多細胞生物體形態發生和細胞分化［11］。此外，HOX基因家族在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中異常表達，且與腫瘤的預后及分期密切相關［12-13］。HOXD3是哺乳動物四種同源盒基因簇之一，在正常成人組織中的表達具有時間特異性及組織特異性，并通過調節細胞運動和細胞間相互作用維持細胞結構的完整性［14］。Miyazaki等［12］研究表明，在人紅白血病和肺癌細胞中，HOXD3高表達可增加TGF-β依賴性和非依賴性信號通路的活性，增強癌細胞的運動能力和侵襲能力。本課題組既往的研究證實，HOXD3高表達乳腺癌患者的5年無進展生存及總生存顯著低于HOXD3低表達者，HOXD3是乳腺癌預后不良的獨立危險因素［13］。本研究進一步證實，HOXD3不僅對乳腺癌細胞干性的維持起重要的作用，同時參與乳腺癌細胞多藥耐藥的產生，針對該分子及其下游通路的靶向治療，可能從根本上抑制乳腺癌細胞自我更新能力，并恢復其對化療藥物的敏感性，從而提高乳腺癌患者的預后。

HOXD3究竟通過何種分子通路發揮其惡性生物學效應，需要進一步探討。研究發現，HOXD3表達與整合素β3呈正相關［15］。整合素β3為細胞表面受體整合素家族成員，通常與整合素αν和β亞單位形成二聚體，表達于細胞表面，參與調節細胞間、細胞與細胞外基質間的相互作用［16］。此外，整合素β3在肺癌細胞中過表達能促進腫瘤細胞產生惡性生物學行為［17］。HOXD3是否通過調節整合素β3表達進而發揮作用的假設，有待進一步探討。

綜上所述，本研究證實HOXD3表達對乳腺癌細胞干細胞樣特性的影響，及HOXD3表達可促進乳腺癌細胞化療耐藥的產生，為更好地認識乳腺癌干細胞的生物學特性，更好地理解乳腺癌耐藥的分子機制，制定逆轉化療耐藥的靶向治療提供潛在靶點。

（2018-02-26收稿）

（2018-06-12修回）