液相芯片技術(shù)在動(dòng)物病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

（浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 311199）

液相芯片技術(shù)（Multi-analyte profiling，solve for unknown x，xMAP technology），是20世紀(jì)90年代中期美國(guó) Luminex公司開(kāi)發(fā)出的被喻為后基因組時(shí)代的芯片技術(shù)。它以微球體代替細(xì)胞作為反應(yīng)載體，可進(jìn)行蛋白、核酸等生物大分子的檢測(cè)，不僅從細(xì)胞水平深入到分子水平，其檢測(cè)范圍也得到前所未有的擴(kuò)展。現(xiàn)就液相芯片的技術(shù)原理、特點(diǎn)及其在動(dòng)物病原微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用做一綜述。

1 基本原理

1995年，美國(guó)Luminex公司將流式細(xì)胞儀、數(shù)字信號(hào)處理器和一種激光檢測(cè)裝置相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種具有多指標(biāo)同步分析（xMAP）功能的芯片技術(shù)，也稱(chēng)為液態(tài)芯片（Liquid chip）或懸浮芯片（Suspension array）。基本原理是：

xMAP技術(shù)以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)平臺(tái)，用許多大小均一穩(wěn)定的微球?yàn)檩d體，微球內(nèi)部含有三種熒光免疫熒光，通過(guò)熒光不同的比例可以區(qū)分500種不同的微球，每種微球可以用來(lái)檢測(cè)一種不同的蛋白或基因。該技術(shù)利用熒光編碼的微球共價(jià)交聯(lián)單克隆抗體，與被測(cè)定的目標(biāo)分子結(jié)合后，加入熒光素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，再通過(guò)激光掃描熒光編碼來(lái)識(shí)別單個(gè)微球和測(cè)量“檢測(cè)熒光”強(qiáng)度來(lái)確定被測(cè)分子的濃度。所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后，用配套軟件分析即可直接用來(lái)判斷結(jié)果。

2 液相芯片的特點(diǎn)

2.1 高通量、速度快

可在同一反應(yīng)體系中放入不同編碼的微球，每種微球?qū)?yīng)一種檢測(cè)物質(zhì)。利用Luminex公司開(kāi)發(fā)的3色熒光編碼技術(shù)，10μl微量標(biāo)本可檢測(cè)多達(dá)500個(gè)指標(biāo)，提高了標(biāo)本的利用率，實(shí)現(xiàn)了樣品的高通量檢測(cè)。整個(gè)雜交反應(yīng)在液相環(huán)境中進(jìn)行，使得雜交反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯著加快，效率顯著提升，大大地縮短了雜交時(shí)間，最快可達(dá)10 000測(cè)試/h。

2.2 特異性好，靈敏度高

微球的表面積大，先通過(guò)特異性的PCR將靶分子數(shù)量擴(kuò)大，再通過(guò)特異性的探針與目標(biāo)分子雜交，每個(gè)微球能結(jié)合約（1～2）×106個(gè)探針?lè)肿樱磻?yīng)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)；兩束不同激光分別檢測(cè)微球上的分類(lèi)熒光信號(hào)和報(bào)告基團(tuán)上的熒光信號(hào)，兩種信號(hào)同時(shí)存在時(shí)才可以檢測(cè)分析。微球表面還可以進(jìn)行化學(xué)處理，進(jìn)一步地提高反應(yīng)的特異性。

2.3 應(yīng)用范圍廣、重復(fù)性好

在微球表面上包被不同的抗原、抗體、細(xì)胞因子、核酸等生物分子，便可檢測(cè)相應(yīng)的目標(biāo)物；可以應(yīng)用商品化檢測(cè)試劑盒或者根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的不同特點(diǎn)，利用分子雜交原理自行設(shè)計(jì)方案。液相芯片技術(shù)相比于以往固相芯片技術(shù)，降低了固相芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受空間效應(yīng)、表面張力等很多反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的干擾，并且增加了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，提高了檢測(cè)樣品的重復(fù)性。檢測(cè)的重復(fù)性可以達(dá)至90%以上，線性范圍寬，動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)4～6 個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.4 操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠

應(yīng)用液相芯片一次檢測(cè)就能完成多份樣品多個(gè)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，節(jié)約了試劑，耗材及勞動(dòng)力，降低了樣品檢測(cè)的成本，提高了分析的效率，液態(tài)芯片在大大提高檢測(cè)效率的基礎(chǔ)上，檢測(cè)試劑比用其他方法檢測(cè)相同指標(biāo)時(shí)價(jià)格更實(shí)惠。檢測(cè)儀器和消耗品相對(duì)固相芯片技術(shù)也便宜。

3 液相芯片在動(dòng)物病原微生物檢測(cè)中應(yīng)用

3.1 液相核酸芯片

朱海紅等（2007）基于懸浮芯片技術(shù)建立的狂犬病毒等56種病原微生物的高通量檢測(cè)微生物診斷技術(shù)平臺(tái)，高通量、快速、可靠且經(jīng)濟(jì)，為突發(fā)傳染病的病原體診斷提供技術(shù)儲(chǔ)備。詹愛(ài)軍等（2010）建立了可以同時(shí)檢測(cè)鹿流行性出血熱病毒、阿卡斑病毒、藍(lán)舌病病毒和水泡性口炎病毒等4 種蟲(chóng)媒病的快速高通量液相芯片技術(shù)，這四種蟲(chóng)媒病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的法定報(bào)告動(dòng)物疫病和我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的一、二類(lèi)動(dòng)物傳染病，為防止此類(lèi)疾病進(jìn)入我國(guó)以及監(jiān)控其在我國(guó)的流行提供了重要的技術(shù)儲(chǔ)備。張曉娜等（2012）成功建立了檢測(cè)H5、H7、H9禽流感，新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒等6種病毒的液相芯片檢測(cè)方法，敏感性、特異性和穩(wěn)定性均較好。王晶鈺等（2012）成功建立了PPV、PCV2 二重xMAP檢測(cè)方法，該方法與標(biāo)準(zhǔn) PCR檢測(cè)符合率為100%，該檢測(cè)技術(shù)可用于出入境檢疫和獸醫(yī)臨床檢驗(yàn)。王政等（2017）建立蝦桃拉病毒、黃頭病毒和白斑病毒檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度高分別為401.5、251.5和75.2 copies。除了檢測(cè)病毒，近年來(lái)也有學(xué)者采用液相基因芯片進(jìn)行細(xì)菌、真菌等臨床鑒定。

3.2 液相蛋白芯片

盧愛(ài)桃等（2008）建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)猴T淋巴細(xì)胞白血病毒I型、猴單純皰疹病毒兩種病毒抗體的液相芯片技術(shù)，對(duì)比ELISA與流式熒光微球檢測(cè)結(jié)果，證明用熒光微球?qū)镅暹M(jìn)行檢測(cè)，不僅比ELISA法快速省時(shí)，而且靈敏度比間接ELISA法高出～100倍。劉志玲等（2012）用xMAP蛋白芯片技術(shù)建立牛地方流行性白血病的檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)牛白血病病毒抗體的檢測(cè)敏感性可達(dá)119.7 ng/μl；批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于10%，試驗(yàn)重復(fù)性良好；所制備的偶聯(lián)微球芯片保存3個(gè)月，其檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，穩(wěn)定性好。蔡月琴等（2013）應(yīng)用制備的兔IgG、IgM和IgA液相芯片建立的xMAP方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與ELISA結(jié)果一致，提示該方法可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)兔血清的IgG、IgM和IgA半定量檢測(cè)。

4 液相芯片的應(yīng)用前景

液相芯片技術(shù)可用于多種生物分子（核酸和蛋白質(zhì)）檢測(cè)，但是這項(xiàng)技術(shù)仍存在著一些難點(diǎn)和缺陷，如不同探針間溫度的差異、檢測(cè)血清中特異性抗體時(shí)檢測(cè)的背景值高對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾等。我們可以相信，隨著研究的不斷進(jìn)展和深入，這些缺陷會(huì)很好的得到解決，今后這一技術(shù)會(huì)成為臨床診斷、基礎(chǔ)研究、新藥開(kāi)發(fā)、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、生物武器防范等領(lǐng)域一項(xiàng)重要的分析檢測(cè)技術(shù)，將大大推動(dòng)生命科學(xué)的研究與發(fā)展。