奶牛結核病檢測方法研究進展

（唐山市動物疫病預防控制中心，河北唐山 063000）

奶牛結核病是由牛分枝桿菌或結核分枝桿菌引起的重要人畜共患病，嚴重危害公共衛生安全、阻礙畜牧業生產和經濟發展，目前被列為國家二類動物疫病。對于規模化奶牛場來說，全面實施“監測、淘汰、消毒”等綜合防控措施，是預防、控制和凈化奶牛結核病的有效途徑，因此，快速準確的檢測方法對該病的凈化至關重要。本文對奶牛結核病常用檢測方法進行簡要概述，便于為控制和最終凈化該病提供檢測技術支撐。

1 常用檢測方法概述

1.1 細菌學檢測方法

1.1.1 涂片-染色-鏡檢

一般采用直接抹片方法，用萋-尼氏染色法進行染色，鏡檢觀察，抗酸桿菌會呈現特征性的紅色，其他細菌和細胞為藍色。此方法檢測分枝桿菌比較快速，但靈敏性及特異性較低。

1.1.2 細菌的分離及培養

常用羅杰二氏培養基、改良羅杰二氏培養基、丙酮酸培養基和小川培養基等選擇性培養基進行分離，由于該菌生長緩慢，一般10～30d才能看到菌落，一般呈現粗糙、隆起、不透明、邊緣不整齊，乳白色或米黃色的顆粒、結節或花菜狀[1]。該方法對操作者的實驗技能要求較高，而且周期過長，實際工作中很少被采用。

1.2 免疫學檢測方法

1.2.1 結核菌素皮內試驗

該方法自1899年建立以來，人們就一直利用它來檢測牛結核病[2]。該方法主要使用提純的牛型結核菌素對牛進行皮內注射，一般劑量為0.1ml，作用72h后觀察注射局部及周圍有無熱痛、腫脹等炎性反應，并以卡尺測量皮皺厚度，通過注射前后皮皺厚度差來判定結果。該方法檢出率和準確率都比較高，被列為牛結核病檢疫的標準方法，但由于各分枝桿菌存在相互交錯的變態反應，經常造成非特異性反應，使該方法的特異性大為降低[3]，同時，該方法需要消耗大量人力，且檢測周期較長，不適用于大規模流行病學調查。

1.2.2 血清學檢測

常用ELISA和膠體金方法檢測牛結核抗體，吳位珩等[4]采用膠體金檢測方法對貴陽省309頭奶牛進行牛結核病檢測，同時用結核菌素皮內試驗作對比，結果兩種方法陽性符合率為75%，陰性符合率93.54%，另種方法的差異極不顯著，該方法便捷、快速，對操作人員、環境等要求不高，適合基層獸醫對牛結核病進行普查和檢疫，但在臨床應用中，相對成本較高。陳萍等[5]采用皮內變態反應和 ELISA 兩種方法對棗莊市中區333頭奶牛進行結核病檢測，并對兩種檢測方法進行了比較研究，兩者初檢符合率98.5%，復檢符合率100%，但該研究中333頭奶牛全為陰性，對于陽性檢出率有待商榷。

血清學檢測方法存在的主要問題是結核菌的抗原性較弱且種屬間抗原決定簇與結核病的相關性還有待進一步研究，使血清學檢測方法難以取得實質性的進展。

1.2.3 γ-干擾素ELISA檢測方法

隨著結核病和免疫學機制研究的進一步深入，發現當感染牛獲得的致敏淋巴細胞再次遇到牛提純結核菌素時，致敏淋巴細胞會釋放大劑量的γ-干擾素，因此，可以通過ELISA方法檢測γ-干擾素來判定牛是否感染結核病，稱之為γ-干擾素ELISA檢測方法。

廖娟紅[6]、尹天燕[7]分別研究了利用γ-干擾素檢測技術檢測奶牛結核的方法，研究結果顯示此檢測技術準確度、特異性都好于PPD 變態反應診斷技術。徐賢坤等[8]運用皮內變態反應和γ-干擾素ELISA檢測方法對廣西5478頭奶牛和1580頭水牛進行牛結核病流行病學調查，并對兩種檢測方法進行對比，發現γ-干擾素ELISA檢測牛結核病陽性率低于皮內變態反應，準確度高。

1.3 分子生物學檢測方法

近年來，國內外學者在牛結核病的診斷和檢測方法方面進行了大量研究，在病原學檢測方面也建立了一些 PCR 診斷方法，劉思國等[9]根據已經發表的牛分枝桿菌的基因序列，設計引物可擴增 294bp目的片段，建立了特異性檢測牛分枝桿菌的 PCR方法，該方法特異性強，敏感度可達到50pg，與PPD皮內試驗比較，陽性樣品符合率為90%，陰性樣品符合率為 100%，但該方法對操作人員、環境要求較高，成本大，只適于個案的診斷，不適于大規模的活畜檢測。

2 結語

國內由北京出入境檢驗檢疫局和中國動物衛生與流行病學中心通過“Bovigam? IFN-γAssay 試劑盒”驗證項目，充分肯定了該技術的先進性和可靠性，但鑒于γ-干擾素試驗在國內的應用尚處于初級階段，在臨床上，最合適的方法是先用皮內變態反應的方法檢疫牛群，再結合γ-干擾素ELISA檢測進行綜合判斷，盡量避免因沒必要的強制撲殺造成的經濟損失，更有利于牛結核病的檢測與凈化。