奶牛結(jié)核病檢測(cè)方法研究進(jìn)展

（唐山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北唐山 063000）

奶牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌引起的重要人畜共患病，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全、阻礙畜牧業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，目前被列為國家二類動(dòng)物疫病。對(duì)于規(guī)模化奶牛場(chǎng)來說，全面實(shí)施“監(jiān)測(cè)、淘汰、消毒”等綜合防控措施，是預(yù)防、控制和凈化奶牛結(jié)核病的有效途徑，因此，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)該病的凈化至關(guān)重要。本文對(duì)奶牛結(jié)核病常用檢測(cè)方法進(jìn)行簡要概述，便于為控制和最終凈化該病提供檢測(cè)技術(shù)支撐。

1 常用檢測(cè)方法概述

1.1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法

1.1.1 涂片-染色-鏡檢

一般采用直接抹片方法，用萋-尼氏染色法進(jìn)行染色，鏡檢觀察，抗酸桿菌會(huì)呈現(xiàn)特征性的紅色，其他細(xì)菌和細(xì)胞為藍(lán)色。此方法檢測(cè)分枝桿菌比較快速，但靈敏性及特異性較低。

1.1.2 細(xì)菌的分離及培養(yǎng)

常用羅杰二氏培養(yǎng)基、改良羅杰二氏培養(yǎng)基、丙酮酸培養(yǎng)基和小川培養(yǎng)基等選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離，由于該菌生長緩慢，一般10～30d才能看到菌落，一般呈現(xiàn)粗糙、隆起、不透明、邊緣不整齊，乳白色或米黃色的顆粒、結(jié)節(jié)或花菜狀[1]。該方法對(duì)操作者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高，而且周期過長，實(shí)際工作中很少被采用。

1.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

1.2.1 結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)

該方法自1899年建立以來，人們就一直利用它來檢測(cè)牛結(jié)核病[2]。該方法主要使用提純的牛型結(jié)核菌素對(duì)牛進(jìn)行皮內(nèi)注射，一般劑量為0.1ml，作用72h后觀察注射局部及周圍有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測(cè)量皮皺厚度，通過注射前后皮皺厚度差來判定結(jié)果。該方法檢出率和準(zhǔn)確率都比較高，被列為牛結(jié)核病檢疫的標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于各分枝桿菌存在相互交錯(cuò)的變態(tài)反應(yīng)，經(jīng)常造成非特異性反應(yīng)，使該方法的特異性大為降低[3]，同時(shí)，該方法需要消耗大量人力，且檢測(cè)周期較長，不適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

1.2.2 血清學(xué)檢測(cè)

常用ELISA和膠體金方法檢測(cè)牛結(jié)核抗體，吳位珩等[4]采用膠體金檢測(cè)方法對(duì)貴陽省309頭奶牛進(jìn)行牛結(jié)核病檢測(cè)，同時(shí)用結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)作對(duì)比，結(jié)果兩種方法陽性符合率為75%，陰性符合率93.54%，另種方法的差異極不顯著，該方法便捷、快速，對(duì)操作人員、環(huán)境等要求不高，適合基層獸醫(yī)對(duì)牛結(jié)核病進(jìn)行普查和檢疫，但在臨床應(yīng)用中，相對(duì)成本較高。陳萍等[5]采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和 ELISA 兩種方法對(duì)棗莊市中區(qū)333頭奶牛進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)，并對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行了比較研究，兩者初檢符合率98.5%，復(fù)檢符合率100%，但該研究中333頭奶牛全為陰性，對(duì)于陽性檢出率有待商榷。

血清學(xué)檢測(cè)方法存在的主要問題是結(jié)核菌的抗原性較弱且種屬間抗原決定簇與結(jié)核病的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究，使血清學(xué)檢測(cè)方法難以取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。

1.2.3 γ-干擾素ELISA檢測(cè)方法

隨著結(jié)核病和免疫學(xué)機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)當(dāng)感染牛獲得的致敏淋巴細(xì)胞再次遇到牛提純結(jié)核菌素時(shí)，致敏淋巴細(xì)胞會(huì)釋放大劑量的γ-干擾素，因此，可以通過ELISA方法檢測(cè)γ-干擾素來判定牛是否感染結(jié)核病，稱之為γ-干擾素ELISA檢測(cè)方法。

廖娟紅[6]、尹天燕[7]分別研究了利用γ-干擾素檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)奶牛結(jié)核的方法，研究結(jié)果顯示此檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確度、特異性都好于PPD 變態(tài)反應(yīng)診斷技術(shù)。徐賢坤等[8]運(yùn)用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA檢測(cè)方法對(duì)廣西5478頭奶牛和1580頭水牛進(jìn)行牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查，并對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)γ-干擾素ELISA檢測(cè)牛結(jié)核病陽性率低于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，準(zhǔn)確度高。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

近年來，國內(nèi)外學(xué)者在牛結(jié)核病的診斷和檢測(cè)方法方面進(jìn)行了大量研究，在病原學(xué)檢測(cè)方面也建立了一些 PCR 診斷方法，劉思國等[9]根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的牛分枝桿菌的基因序列，設(shè)計(jì)引物可擴(kuò)增 294bp目的片段，建立了特異性檢測(cè)牛分枝桿菌的 PCR方法，該方法特異性強(qiáng)，敏感度可達(dá)到50pg，與PPD皮內(nèi)試驗(yàn)比較，陽性樣品符合率為90%，陰性樣品符合率為 100%，但該方法對(duì)操作人員、環(huán)境要求較高，成本大，只適于個(gè)案的診斷，不適于大規(guī)模的活畜檢測(cè)。

2 結(jié)語

國內(nèi)由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局和中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心通過“Bovigam? IFN-γAssay 試劑盒”驗(yàn)證項(xiàng)目，充分肯定了該技術(shù)的先進(jìn)性和可靠性，但鑒于γ-干擾素試驗(yàn)在國內(nèi)的應(yīng)用尚處于初級(jí)階段，在臨床上，最合適的方法是先用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的方法檢疫牛群，再結(jié)合γ-干擾素ELISA檢測(cè)進(jìn)行綜合判斷，盡量避免因沒必要的強(qiáng)制撲殺造成的經(jīng)濟(jì)損失，更有利于牛結(jié)核病的檢測(cè)與凈化。