細菌感染多重核酸檢測試劑參考品的建立

劉東來，周海衛，石大偉，沈　舒，田亞賓，張春濤

細菌感染可以引發多種疾病，臨床上須要及時診斷。傳統細菌鑒定基于培養法，是將患者體液標本置于適宜的培養基上培養增殖，然后鑒定培養物。但是，培養法對臨床樣本消耗量大且檢測周期長，難以分辨多種細菌混合感染，以及很多致病性細菌難以分離培養等，導致傳統的鑒定方法有時不能滿足臨床診斷需求[1-2]。分子診斷技術檢測速度快，靈敏度、特異性和可重復性好，在突發性感染的評估，感染早期的發現、監測以及細菌耐藥性分析等領域占據重要地位[3-5]。隨著分子診斷技術的快速發展以及臨床需求的不斷增加，多重核酸檢測技術應運而生。該技術是指在一個核酸檢測體系中加入多對擴增引物，同時對多個病原體進行靶向擴增。通過與其他檢測技術聯用，多重核酸檢測技術能夠同時對一份樣本檢測多種病原體并快速報告結果，該項技術正越來越多地應用于臨床診斷并受到廣泛關注[6-10]。常見的多重核酸檢測試劑的方法包括PCR、熔解曲線、等溫擴增以及第二代測序技術（又稱高通量測序或下一代測序技術）等[11-12]。目前，FDA已經批準12個單次可檢測20余種細菌感染的多重核酸檢測試劑，檢測范圍覆蓋中樞神經系統、血液、呼吸道、腸道以及生殖道感染相關細菌[13]。我國的相關行業尚處于起步階段，國家食品藥品監督管理總局僅批準1個基于等溫擴增技術的細菌多重核酸檢測試劑。

參考品是相關試劑質量評價的基礎以及審評審批的重要依據[14-17]。為適應細菌多重核酸檢測試劑的性能特點，須要建立創新性的質量評價方法。本研究建立了細菌感染多重核酸檢測試劑參考品并制定其質量標準。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 候選參考品來源 候選參考品包括28株細菌，分別是屎腸球菌ATCC 700221、肺炎鏈球菌ATCC BAA-255、粘質沙雷氏菌ATCC 27137、大腸桿菌ATCC 43888、表皮葡萄球菌ATCC 12228、鮑曼不動桿菌ATCC 9955、肺炎克雷伯菌BAA-1705、緩癥鏈球菌ATCC 15914、糞腸球菌ATCC 700802、產酸克雷伯菌ATCC 13182、化膿鏈球菌ATCC 19615、流感嗜血桿菌ATCC 10211、金黃色葡萄球菌ATCC BAA-1747、奇異變形桿菌ATCC 29906、無乳鏈球菌ATCC 13813、單核細胞增多李斯特菌ATCC 19115、陰溝腸桿菌ATCC 13047、銅綠假單胞菌ATCC 27853、腦膜炎奈瑟菌ATCC 43744、藤黃微球菌ATCC 49732、馬紅球菌ATCC 6939、格氏李斯特菌ATCC 700545、瓊氏不動桿菌ATCC 17908、副流感嗜血桿菌ATCC 9796、干燥奈瑟菌ATCC 9913、熒光假單胞菌ATCC 13525、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、嗜肺軍團菌ATCC 33152；6株真菌分別是近平滑念珠菌ATCC 90875、葡萄牙假絲酵母ATCC 34449、熱帶假絲酵母ATCC 66029、克柔念珠菌ATCC 90878、光滑念珠菌ATCC 15545、白色念珠菌ATCC 10231。上述菌株均由本單位保存并提供。

1.1.2 儀器和試劑 細菌培養使用腦心浸液培養基、甘露醇瓊脂培養基、哥倫比亞瓊脂培養基、哥倫比亞血瓊脂培養基、巧克力瓊脂培養基、大豆酪蛋白瓊脂培養基、軍團菌GVPC選擇瓊脂培養基；厭氧產氣袋。細菌鑒定使用革蘭陰性細菌鑒定卡（VITEK2 GN）；革蘭陽性細菌鑒定卡（VITEK2 GP）；奈瑟氏菌及嗜血桿菌鑒定卡（VITEK2 NH）；酵母菌鑒定卡（VITEK2 YST）；革蘭陰性細菌藥物敏感性（藥敏）鑒定卡（VITE2 ASTGN）；革蘭陽性細菌藥敏鑒定卡（VITEK2 ASTGP）。上述培養基及鑒定卡均購自梅里埃診斷產品（上海）有限公司。細菌生化鑒定使用的全自動細菌鑒定及藥敏分析系統（VITEK2）由梅里埃診斷產品（上海）有限公司提供。細菌全基因組測序驗證應用的第二代測序服務購自華大基因。

候選參考品協作標定使用的多重核酸檢測的商品化或自建試劑包括呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒、致病性細菌核酸檢測試劑盒、侵襲性真菌核酸檢測試劑盒、血培養病原體及其耐藥基因檢測試劑盒、血流感染常見病原體檢測試劑盒和細菌感染檢測試劑盒，由博奧生物集團有限公司、華大基因、卡尤迪生物科技（北京）有限公司以及梅里埃診斷產品（上海）有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養及鑒定 本單位保存的34株細菌和真菌均為凍干粉狀態。一般地，菌株先加入200 μl肉湯培養基復溶，混勻后劃線接種于合適的固體培養基平板，35 ℃孵育培養24～36 h。挑取單個菌落，置于35 ℃孵育培養24～36 h傳代培養。屎腸球菌和糞腸球菌培養使用腦心浸液培養基；金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌培養使用甘露醇瓊脂培養基；馬紅球菌、藤黃微球菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、近平滑念珠菌、葡萄牙假絲酵母、熱帶假絲酵母、克柔念珠菌、光滑念珠菌和白色念珠菌培養使用哥倫比亞瓊脂培養基；化膿鏈球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌和陰溝腸桿菌培養使用哥倫比亞血瓊脂培養基；單核細胞增多李斯特菌、格氏李斯特菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌和干燥奈瑟菌使用巧克力瓊脂培養基；鮑曼不動桿菌、瓊氏不動桿菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和粘質沙雷氏菌培養使用大豆酪蛋白瓊脂培養基；嗜肺軍團菌使用軍團菌GVPC選擇瓊脂培養基。須要注意的是：化膿鏈球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、干燥奈瑟菌和嗜肺軍團菌須要使用厭氧產氣袋進行厭氧培養，其中嗜肺軍團菌生長緩慢，須培養96～120 h。

菌株的鑒定使用全自動細菌鑒定及藥敏分析系統及其配套鑒定卡，所有操作按照儀器及鑒定卡說明書進行。

1.2.2 菌株濃度測定 應用梯度稀釋法對鑒定正確的菌株的菌落形成單位濃度進行測定[18]。簡單的，菌株重新劃線接種于合適的固體培養基平板進行培養。使用3 ml無菌生理鹽水沖洗固體培養基表面的菌落，并配制一定麥氏濁度單位的菌懸液，細菌按照0.5 MCF約為1.0×108CFU/ml估算，真菌按照0.5 MCF約為1.0×106CFU/ml估算。將上述菌懸液按10倍梯度進行稀釋，取100 μl稀釋液劃線接種于合適的固體培養基平板上培養24～36 h。選擇菌落數為30～300個的平板進行人工計數并計算原始菌液的濃度。所有實驗重復2次并計算平均值。

1.2.3 混合樣本制備及驗證 將34株已知濃度的菌株進行分組、混合，參考FDA頒布的病原體多重核酸檢測試劑指導原則[19-22]，WHO公布的第一代細菌混合參考品[23]，以及在美國批準上市的相關試劑的臨床數據[24-25]，制定本參考品的混合原則。其中主要包括：同一混合樣本中的菌株數量不超過5株，其濃度應盡量相近且避免全部為革蘭陽性細菌、革蘭陰性細菌或真菌[19-22]。混樣本中的菌株應為較高濃度，細菌應約為 1×108～ 1×109CFU/ml，真菌應約為1×106～ 1×107CFU/ml。實驗室操作應避免交叉污染。

混合樣本制備完成后進行測序驗證。委托華大基因應用第二代測序技術對樣本中所有菌株的全基因組進行測序，以驗證混合樣本中菌株的組成及交叉污染情況。

1.2.4 協作標定及質量標準的制定 經過培養、濃度測定、混合及鑒定的混合樣本組成細菌性感染多重核酸檢測試劑候選參考品。協作標定使用4家公司的7個檢測試劑（盲編為A～G），根據各自產品特點對候選參考品進行適當稀釋后，按照說明書進行檢測。所有參考品均封盲檢測，檢測結果匯總后再行揭盲。根據協作標定的有效結果，最終確定參考品質量標準。

1.2.5 穩定性試驗 取一套參考品置于室溫條件（約25 ℃）下進行3次反復凍融處理，然后使用一種多重核酸試劑進行檢測，并委托華大基因進行測序。檢測結果與正常儲存（-20 ℃）的參考品進行比較，以考核參考品的凍融穩定性。此外，還將對參考品長期穩定性進行監測，計劃每年2次。

2　結　果

2.1 參考品組成 本研究選擇34株臨床上可導致腦膜炎，敗血癥，呼吸道、腸道及生殖道等感染的致病性細菌和真菌。全部菌株經過培養、全自動細菌鑒定及藥敏分析系統鑒定正確后并測定濃度，最后進行分組混合。34株高濃度的細菌和真菌被分成7組（M1～M7），其中M1～M6分別包含5種病原體，M7包含4種病原體。此外，每個混合樣本中均含有革蘭陽性細菌、革蘭陰性細菌或真菌。參考品具體組成見表1。

表1 參考品組成Table 1 Composition of reference material

2.2 參考品驗證 應用第二代測序技術，分別對混合參考品M1～M7中菌株的全基因組進行測序驗證，結果見表2。結果顯示M1中5種細菌的總序列占比為99.4%；M2～M5中5種細菌和真菌的總序列占比分別為：90.1%、99.0%、98.7%、98.7%、99.1%；M6中5種細菌的總序列占比為97.7%；M7中4種細菌和真菌的總序列占比為97.7%。分析測序結果，M1～M7中的細菌和真菌的組成與預期相符，且參考品特異性經過驗證不存在交叉反應。

2.3 協作標定及質量標準的制定 參加協作標定的7個試劑（試劑A～G）的檢測方法包括PCR-熔解曲線、等溫擴增和第二代測序技術。試劑A～C為基于等溫擴增技術的多重核酸檢測試劑，檢測范圍分別包括13種下呼吸道細菌、16種致病性細菌和16種侵襲性真菌；試劑D為基于PCR和熔解曲線技術的多重核酸檢測試劑，檢測為24種血流感染相關細菌和真菌；試劑E～G為基于第二代測序技術（包括華大基因、Illumina和賽默飛世爾公司的高通量測序平臺）的多重核酸檢測試劑，其中試劑E的為25種血流感染相關細菌和真菌，試劑F和G靶向性檢測細菌16S rRNA基因。

表2 參考品測序驗證結果Table 2 Results of reference materials sequencing

協作標定結果見表3。試劑A檢測出9種細菌；試劑B檢測出15種細菌；試劑C檢測出5種真菌；試劑D和E均檢測出24種細菌和真菌；試劑F檢測出10種細菌；試劑G檢測出25種細菌。根據各試劑產品說明書，試劑A～E對于檢測范圍內的細菌和真菌均檢出，且不在檢測范圍內的細菌和真菌均未檢出；試劑F和G未檢出的細菌數分別為18種和3種。

參考品M1～M7進行10倍系列梯度稀釋后，分別使用試劑B、C和D檢測，結果見表4。檢測原倍、10倍稀釋和100倍稀釋的M1～M7時，試劑B和D的檢測結果均符合預期，試劑C則未能檢測到100倍稀釋的M5中的近平滑念珠菌。檢測1000倍和10 000倍稀釋后的M1～M7時，試劑B、C和D未檢出的菌株數量均較多（數據未展示）。此外，參考品在各稀釋梯度均未發生交叉反應。

表3 參考品協作標定結果Table 3 Results of collaboration study

2.4 參考品穩定性 參考品M1～M7置于室溫條件（約25 ℃）下反復凍融3次處理后，與-20 ℃保存且未經凍融處理的參考品均使用試劑D進行檢測，參考品M3和M6進行全基因組測序，檢測結果見表5。分析結果顯示，反復凍融3次處理并未影響參考品的穩定性。

表4 梯度稀釋參考品檢測結果Table 4 Results of detecting gradient dilution of reference material

3　討　論

多重核酸檢測技術在多重病原體診斷領域的應用帶來了更好的時效性、準確性以及靈敏度[8]。FDA不僅先后批準了多個多重核酸診斷試劑產品，更重要的是其頒布的4個專項指導原則對此類試劑的發展具有重要指導意義，推動了行業發展[13，19-22]。而目前我國仍缺少多重核酸診斷試劑相關的專項法規或指南。病原體核酸檢測試劑參考品是經過鑒定的具有代表性的一系列臨床分離培養樣本或模擬樣本，按照特定組成形式建立的，是相關試劑質量控制和評價的核心以及產品審評過程的重要依據之一[17]。傳統單一病原體核酸檢測試劑的參考品組成一般包括數個陽性參考品、陰性參考品、重復性參考品以及最低檢出限參考品，用以全面評價試劑的準確性、特異性、重復性和靈敏度等核心性能[14-16]。如按上述思路，以某個試劑的檢測能力為24種細菌為例，須要設置500余個參考品。基于數量龐大的參考品的質量評價體系，不僅對于企業和監管部門是沉重的負擔，更嚴重的是由于缺少混合形式的參考品，該評價體系不能針對多重核酸檢測試劑的技術特點進行全面評價。因此，美國監管部門建議使用混合樣本評價多重核酸檢測試劑的性能[19-22]。

表5 穩定性檢測結果Table 5 Results of stability test

本研究建立的細菌感染多重核酸檢測試劑參考品，由7支混合參考品組成，包括了34株經過鑒定和驗證且濃度已知的致病性細菌和真菌。參考品制備完成后應用不同試劑進行協作標定并根據檢測結果確定質量標準：陽性符合率（即準確性）應為檢測經稀釋（終濃度應不低于1.0×105CFU/ml）的混合參考品M1～M7，在產品檢測范圍內的病原菌均應檢出，且與已知型別相符，不在產品檢測范圍內的病原菌均不應檢出；陰性符合率（即特異性）應為檢測經稀釋（終濃度應不低于1.0×105CFU/ml）的混合參考品M1～M7，不在產品檢測范圍內的病原菌均不應檢出；重復性應為檢測稀釋至低濃度（不高于產品宣稱最低檢出限的10倍）的混合參考品M1～M7，分別重復檢測10次，在產品檢測范圍內的病原菌均應檢出，且與已知型別相符，不在產品檢測范圍內的病原菌均不應檢出；最低檢出限應為檢測經10倍系列稀釋的混合參考品M1～M7，終濃度為產品宣稱的最低檢出限濃度及以上時，在產品檢測范圍內的病原菌均應檢出，且與已知型別相符，不在產品檢測范圍內的病原菌均不應檢出。本研究對參考品的凍融穩定性進行了詳細考察，但是仍缺少參考品長期穩定性數據，在后續研究中應補充完整并持續監測。

本參考品具有以下優勢：一是能大幅減少參考品數量；二是能夠考察試劑對多個待測菌株的混合樣本的分辨率；三是能夠考察非待測菌株對待測菌株的干擾；四能夠考察樣本中高濃度背景核酸對低濃度待測核酸的干擾。然而作為第一代參考品，其所覆蓋的病原菌數量有限，后續換批、換代過程中應考慮逐漸增加菌株數量并適當提高其質量標準。