雷公藤紅素通過調節脂質合成及氧化降低HepG2細胞甘油三酯水平的研究

馮澤民，萬星勇，虞朝輝，厲有名

雷公藤紅素是從雷公藤屬植物根部中提取的一種五環三萜類化合物，具有多種生物學功能，其抗炎和抗氧化作用可以用來治療自身免疫性疾病及神經退行性疾病[1]。近年來，雷公藤紅素在脂質代謝中的作用受到了越來越多的關注。Ma等[2]發現雷公藤紅素可以激活熱休克因子1，后者通過激活過氧化物酶體激活受體γ共激活劑 -1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC1A）相關的代謝程序調控能量消耗，最終能治療小鼠肥胖及胰島素抵抗。Guan等[3]報道雷公藤紅素可以通過激活AMPK-PGC1A通路，減輕糖尿病大鼠的骨骼肌氧化應激。雷公藤紅素是否在非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）的發生發展中起作用尚未明確。本研究旨在通過軟脂酸（palmitic acid,PA）誘導的NAFLD細胞模型，研究雷公藤紅素是否能降低HepG2細胞內TG含量，從而進一步探究其參與NAFLD發生發展的具體機制。

1　材料與方法

1.1 細胞培養 HepG2細胞購于美國模式培養物集存庫，用含10%胎牛血清的培養基培養于37 ℃、5% CO2培養箱中。

1.2 實驗試劑 DMEM培養基及胎牛血清均購于美國Gibco公司；抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH ）、固醇調節因子結合蛋白（sterol-regulatory element-binding protein1c, SREBP-1c）以及脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）購于美國CST公司；PA及雷公藤紅素購于美國Sigma公司；細胞活性檢測試劑盒CCK-8購自日本同仁化學研究所；TG測定試劑盒購自北京普利萊有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HepG2細胞活度測定 將細胞懸液100 μl（約5000個細胞）接種至96孔板中，每個處理水平及對照均設置5個復孔，37 ℃、5% CO2培養24 h。吸盡96孔培養板中的培養基，PBS洗2遍。每孔加10 μl CCK-8試劑+90 μl DMEM培養基，空白對照加空白的CCK-8液。37 ℃、5% CO2培養箱放置1 h，450 nm波長下測定吸光度。細胞活度（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100。

1.3.2 PA誘導NAFLD細胞模型的建立以及雷公藤紅素處理 PA以25%胎牛血清白蛋白懸浮，超聲震蕩至無顆粒狀懸浮后于37 ℃水浴過夜，0.22 μm濾頭過濾后制備成20 mmol/L濃度儲備液于-20 ℃冰箱保存。HepG2細胞按照2×105/孔的密度鋪于6孔板，24 h后細胞密度約30%左右，按照PA200 μmol/L（儲備液稀釋100倍）以及指定濃度雷公藤紅素更換培養基，細胞換液48 h后用于TG測定以及蛋白、RNA提取。

1.3.3 細胞內TG水平測定 采用TG測定試劑盒及分光光度儀，根據GPO Trinder酶學反應原理檢測細胞內TG濃度。先將試劑盒中不同濃度TG標準品加入TG工作液，然后用分光光度儀檢測550 nm處吸光值（OD550）并繪制TG濃度標準曲線。104～105個靶細胞中加入100 μl試劑盒中TG裂解液，冰浴10 min，取40 μl裂解液用于蛋白濃度測定，其余裂解液70 ℃水浴10 min，室溫2000 r/min 離心5 min，取上清加入TG工作液后檢測OD550值，根據標準曲線獲得TG濃度。檢測中采用樣本蛋白含量校準TG含量。

1.3.4 蛋白電泳 用0.05% NaTDC-PBS溶解靶細胞，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清用蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。等量蛋白樣本電泳結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，以兔抗人或鼠SREBP-1c、FAS為一抗，HRP標記羊抗兔IgG為二抗。采用Western blot檢測目的蛋白雜交條帶，實驗中設置GAPDH為內參。

1.3.5 定量即時聚合酶鏈鎖反應 靶細胞用0.05%胰酶消化，常規離心及PBS洗滌后取細胞沉淀用RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度法測定總RNA濃度。PGC1A引物序列：上 游 引 物 5′- TCTGAGTCTGTATGGAGTGACAT-3′，下 游 引 物 5′- CCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA-3′；過氧化物酶體增殖物激活受體γ （peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）引物序列：上游引 物 5′- GGGATCAGCTCCGTGGATCT-3′， 下 游 引 物5′- TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT-3′；GAPDH 引物序列：上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下 游 引 物 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。然后按反轉錄試劑盒（TaKaRa）和SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）說明書操作并檢測各靶基因mRNA，ΔΔCt模型定量分析結果，實驗中采用GAPDH-mRNA為內參。

1.4 統計學處理 用 SPSS 17.0 統計軟件對數據進行處理，計量資料呈正態分布，用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，各處理組與對照組兩兩比較用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1 雷公藤紅素對HepG2細胞活度的影響 雷公藤紅素在低濃度（＜800 nmol/L）下對HepG2細胞活度無顯著影響；在800 nmol/L以及1000 nmol/L濃度下細胞活度略有降低但仍＞80%（88.00%，85.69%）；在2000 nmol/L甚至更高時細胞活度顯著降低（圖1）。

圖1 不同濃度雷公藤紅素對HepG2細胞活度的影響F=190.900，P=0.000，n=5；*.與雷公藤紅素0 nmol/L組比較，P均＜0.05Figure 1 Different concentrations of celastrol effect on HepG2 cell viability

2.2 雷公藤紅素對PA誘導的HepG2細胞TG水平的影響 根據雷公藤紅素的細胞活度實驗結果，選取5個不同濃度的雷公藤紅素刺激HepG2細胞。PA（200 μmol/L）單獨刺激組較正常對照組，HepG2細胞內TG水平顯著升高[（69.32±1.79）μg/mg vs.（54.07±2.57）μg/mg]。同時加用雷公藤紅素可顯著降低細胞內TG水平，其中400 nmol/L組、600 nmol/L組、800 nmol/L組、1000 nmol/L組的TG 水平分別為（64.55±1.92）μg、（64.16±2.19）μg、（60.94±2.70）μg、（61.45±1.61）μg、較 PA 組差異有統計學意義（P均＜0.05）（圖2）。

圖2 不同濃度雷公藤紅素對HepG2細胞TG水平的影響F=19.570，P=0.001，n=5；*.與雷公藤紅素0 nmol/L組比較，P均＜0.05Figure 2 Different concentrations of celastrol effect on triglyceride levels in HepG2 cells

2.3 雷公藤紅素對HepG2細胞脂質合成相關蛋白SREBP1c及FAS表達的影響 在PA（200 μmol/L）單獨刺激下，HepG2細胞的脂質合成相關蛋白SREBP1c及FAS的表達顯著升高，而同時以雷公藤紅素600 nmol/L以及1000 nmol/L濃度刺激可下調此2種蛋白表達（圖3）。

圖3 雷公藤紅素降低HepG2細胞脂質合成蛋白SREBP1c以及FAS表達水平Cel.雷公藤紅素Figure 3 Celastrol decreases the expression levels of lipid synthesis proteins, SREBP1c and FAS in HepG2 cells

2.4 雷公藤紅素對HepG2細胞脂質氧化相關基因PGC1A及PPARγ表達的影響 PA（200 μmol/L）單獨刺激下，HepG2細胞脂質氧化相關基因PGC1A及PPARγ表達均下調，但差異無統計學意義。同時以雷公藤紅素刺激可升高此2種基因表達，其中PPARγ表達水平在600 nmol/L以及1000 nmol/L濃度下分別為1.11±0.09（相較正常對照組，下同）以及1.16±0.05，與PA組0.86±0.07相比，差異具有統計學意義（P均＜0.05）（圖4）。

3　討　論

NAFLD是指除酒精和其他明確的肝損傷因素以外病因所致、以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征[4]。近年我國成人NAFLD患病率已約達到20%，且其發病率逐年升高[5]。NAFLD發生發展機制目前尚未完全明確，最為公認的發病機制為二次打擊學說[6]，其治療也缺乏特別有效的方法。

目前認為，雷公藤紅素減輕肥胖及糖尿病的關鍵分子PGC1A在NAFLD的發生發展中起重要作用。在小鼠肝臟，敲除或抑制PGC1A表達可導致肝細胞脂肪變性、肝臟炎癥及慢性肝臟損傷[7-8]。PGC1A可以通過上調過氧化物酶激活受體 α（peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα）轉錄活性，并協同PPARα增強其下游線粒體脂肪酸β氧化相關基因肉堿棕櫚酰基轉換酶、極長鏈酰基輔酶A脫氫酶，長鏈酰基輔酶A脫氫酶及酰基輔酶A的表達，減輕肝臟脂肪變性[9]。Choi等[10]觀察到雷公藤紅素能有效抑制脂肪細胞3T3-L1的分化，進一步研究還發現，雷公藤紅素對脂肪細胞脂質代謝的調節作用與其對PPARγ表達抑制相關。在高脂飲食誘導的NAFLD小鼠模型中，厄貝沙坦可以減輕小鼠肝細胞脂肪變性，而小鼠肝臟 PPARγ表達上調，提示增加PPARγ的表達可以減輕肝臟脂肪變性[11]。有研究指出雷公藤紅素能抑制NF-κB通路及其下游促炎癥因子IL-1β、TNF-α的釋放，減輕糖尿病大鼠的肝臟炎性細胞浸潤[12-13]。

在本研究中，PA誘導的NAFLD細胞模型中，雷公藤紅素能顯著降低細胞內TG含量，并呈現濃度依賴性。考慮到只用HepG2 1種肝細胞株不夠有說服力，研究還選取了鼠源性肝細胞株AML作為研究對象，但雷公藤紅素無法降低AML細胞內TG含量（文中未顯示），提示雷公藤紅素降低TG可能存在種屬特異性。進一步的機制探究實驗表明，該作用可能與雷公藤紅素降低HepG2細胞脂質合成蛋白SREBP1c以及FAS表達水平以及上調脂質氧化相關基因PPARγ的表達水平有關。當然，更嚴謹的機制探索還須要借助于siRNA干擾靶分子及其抑制劑以及激動劑來進一步證明。同時，本研究后續還應納入NAFLD動物模型實驗來更全面論證雷公藤紅素在治療NAFLD中的作用，以期更好地解決這一全球性健康難題。

圖4 雷公藤紅素上調脂質氧化相關基因PGC1A及PPARγ的表達水平PGC1A 表達4組比較，F=2.738，P=0.113，n=3；PPARγ表達4組比較，F=7.326，P=0.011，n=3；*.與雷公藤紅素0 nmol/L組比較，P均＜0.05Figure 4 Celastrol increases the mRNA levels of lipid oxidation-related genes, PGC1A and PPARγ