19個X-STR 基因座在中國3個民族的遺傳學調查及法醫學應用

劉亞舉，龍　飛，李　瑾，岳俊濤，石美森

(1.河南省許昌市公安局 刑事科學技術研究所，河南 許昌 461000；2.貴州省遵義市公安局 刑偵支隊，貴州 遵義 563000； 3.中國政法大學 證據科學教育部重點實驗室， 北京 100192)

由于人類X染色體獨特的遺傳性質，X染色體短串聯重復序列(X chromosome-short tandem repeat，X-STR)在法醫實踐中具有獨特的應用價值[1]，在父母缺失的同父異母姐妹鑒定、祖母-孫女關系鑒定、父女關系鑒定、個體識別中性別的輔助檢驗和男性混合樣本的判讀等案件中往往能提供一定的證據信息。本研究采用MicroreaderTM19X ID System身份鑒定系統19X試劑盒，對中國漢族、仡佬族和苗族人群進行19個X-STR基因座的遺傳多態性調查，評估其作為法醫學遺傳標記的效能，積累相應X-STR基因座群體遺傳學數據，為法醫個體識別和親子鑒定提供資料。

1　材料與方法

1.1　樣本

根據知情同意原則，從健康體檢人群中隨機采集漢(308名，男女各154名)、仡佬(398名，男性296名、女性102名)和苗(323名，男性220名、女性103名)族無關個體外周血0.1 mL，滴入采血卡(武漢驥騰公司)，陰干后常溫保存。該研究得到相關道德倫理委員會批準。

1.2　方法

根據MicroreaderTM19X ID System熒光檢測試劑盒說明書，用直擴法(免提取)對前述血樣進行PCR擴增。在Mastercycler pro S銀座熱循環儀(Eppendorf公司)上進行復合擴增，反應體系為10 μL，內含2.5×緩沖液C 4 μL、5×19X Primer Mix 2 μL、Taq PolymeraseⅡ 0.2 μL、純水3.8 μL和1.2 mm直徑血樣。熱循環參數為：96 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 70 s，30個循環； 60 ℃ 30 min；15 ℃保溫。取1 μL擴增產物與0.5 μL內標Org500和8.5 μL去離子甲酰胺混合，95 ℃變性3 min后，冰浴3 min，置3500XL型遺傳分析儀(AB公司)上全自動毛細管電泳，Data Collection軟件收集數據，用GeneMarker? HID分析軟件(SoftGenetics公司)進行等位基因分型，并采用GeneMapper ID-X v1.5分析軟件(AB公司)復核分析。每批樣本檢測均采用 9947A(AB公司)和超純水分別作為陽性對照和陰性對照。19個X-STR基因座的基本信息(表1)。

1.3　統計學分析

用PowerMarker? v3.25軟件分別統計3個民族的男性個體和女性個體在19個X-STR基因座的等位基因分布頻率。用Arlequin v3.5軟件對男性群體和女性群體之間各基因座的等位基因頻率分布差異進行Fisher，s精確檢驗，并對19個X-STR基因座在3個民族群體中的基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗及各個基因座間的連鎖不平衡情況進行檢驗。同時用PowerMarker? v3.25軟件和Cervus3.0軟件統計19個X-STR基因座在3個民族無關個體中的等位基因分布頻率,使用http://www.chrX-STR.org網站[2]在線計算功能，用男女合并后數據計算所得等位基因頻率，統計分析各個基因座在男性群體的個人識別率(DPM)，在女性群體的個人識別率(DPF)、雜合度(H)、三聯體平均非父排除率(MECtrio)、二聯體平均非父排除率(MECduo)和多態信息含量(PIC)等法醫學參數值[3- 4]。采用Arlequin v3.5軟件進行19個X-STR基因座的等位基因分布與其他地區已有人群數據[5- 7]的差異比較。

表1　19個X-STR基因座的基本信息Table 1　General information of 19 markers included in the MicroreaderTM19X ID system

2　結果

2.1　19個X-STR基因座的檢測結果

經陽性對照9947A反復測試，結果未見明顯變化。等位基因分型標準物(ladder)和3個民族1 029名無關個體均獲得清晰的電泳圖譜，分型結果明確(圖1)。男性個體每個基因座均只顯現一個等位基因峰，女性個體則有1個(純合子)或2個等位基因(雜合子)峰。

2.2　19個X-STR基因座的等位基因頻率分布

308名漢族(男女各154名)、398名仡佬族(男性296名，女性102名)和323名苗族(男性220名，女性103名)無關個體中分別檢出172、176和186種等位基因。經Fisher’s精確檢驗，男性和女性群體等位基因的頻率分布差異無統計學差異，因此用男女合并后數據計算所得人群等位基因頻率分布(表2，Freq1漢族、Freq2仡佬族、Freq3苗族)。等位基因分型標準物之外的稀有等位基因(off-ladder allele)被檢出(表2中粗體標記的等位基因)。

2.3　群體遺傳學參數

19個X-STR基因座中，漢族除DXS10162外，仡佬族除DXS9907、DXS7423、DXS6810、GATA165B12及DXS10135外，苗族除DXS6795、DXS6800、DXS981及DXS10162外，基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，采用Bonferroni法修正，將P值設為0.0026(0.05/19)，發現19個X-STR基因座的基因型頻率分布在3個民族群體中均達到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。19個X-STR基因座在3個民族人群的遺傳學參數(表3)。

2.4　19個X-STR基因座的基因連鎖不平衡分析

對19個X-STR基因座兩兩之間進行連鎖不平衡檢驗，所有基因座兩兩之間均處于連鎖平衡狀態。

圖1　等位基因分型標準物和內標分型圖普Fig 1　Electropherogram of allelic ladders and internal size standard in the MicroreaderTM19X ID system

DXS6807DXS7423DXS9902alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3100.0025130.00490.01010.007770.00320.0050110.41720.45100.4907140.30680.30280.309680.00320.0031120.00810.00880.0077150.63470.63440.617590.02270.01880.0124130.02920.01380.0139160.04870.05150.0619100.44160.46110.4892140.32470.36930.3437170.00490.00130.0031110.31660.32290.3096150.18510.14200.1331120.20450.18340.1811160.03080.01260.0077130.00810.00750.0046170.00490.0031140.0013DXS6810DXS7133GATA165B12alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3140.003260.00490.00500.001570.0016150.00320.003870.004680.0025160.00970.00500.006280.00160.00750.006290.22560.27140.2895170.16070.16080.140990.74510.77760.7910100.55680.49120.4783180.48860.54020.5866100.19640.17590.1378110.18510.18340.1563190.32310.28390.2399110.05190.03270.0588120.03080.05150.0511200.01140.00630.0232120.0013130.0248210.0031

續表2

續表2

2.5　與其他地區人群X-STR基因座的頻率分布比較

對本研究的3個民族之間的頻率分布進行比較分析，并分別與河南漢族(n=326)[5]、山東漢族(n=481)[6]、華東漢族(n=200)[7]群體比較，結果見表4[表中粗體標記的差異具有統計學意義(P<0.05)；-表示沒有數據]。

表3　19個X-STR基因座的群體遺傳學參數及Hardy-Weinberg平衡檢驗結果(P值)

續表3

表4　不同人群間X-STR基因座的等位基因頻率分布差異檢驗結果(exact P值)Table 4　Exact P values based on the comparison of allele frequencies in 6 national studies

續表3

3　討論

X-STR基因座核心重復單位有3和4核苷酸，本研究的19個X-STR基因座4核苷酸居多，有17個，占89.47%，因為擴增產物中這類基因座比3核苷酸重復序列的影子帶少。另外，19個X-STR基因座的選擇也避開了4個連鎖群[8- 9]，連鎖度較低。

人類群體是一個具有多樣性特征的大群體，每一個種族的基因組經過長期進化過程而具有其自身所特有的征象，通過對各個種族的遺傳結構特點及變化規律的研究，有助于在法醫DNA、人類進化、種族起源和族群關系等方面的研究。中國有56個民族，研究中國不同民族群體的遺傳多態性，不僅對全面了解各民族群體的遺傳多態性和他們之間的相互關系有著非常重要的意義，同時也可以為探討人群的起源及遷徙路線提供重要的科學依據。因此，X-STR基因座在不同人群的多態性數據是法醫DNA應用、群體遺傳學研究的基礎，不同地域、不同民族X-STR基因座的頻率分布存在差異，能夠為群體遺傳學和種群識別帶來一定的促進作用[8- 9]。本次群體差異比較顯示，19個X-STR基因座在不同區域和不同種族之間具有差異，所以，在進行法醫學證據價值評估時選擇對應的群體是科學和必要的，這種結果也將為了解種族的起源與流轉及其語言學、考古學等學科提供重要的理論依據和參考資料。

多態性分析結果表明，19個X-STR基因座中，DXS7133和DXS6800具有中度多態性，其余17個基因座均具有高度多態性(PIC>0.5，H>0.5)，經Bonferroni法修正，將p值設為0.0026(0.05/19)，發現19個X-STR基因座的基因型頻率分布在3個民族群體中均達到Hardy-Weinberg平衡，在漢、仡佬、苗族女性群體和男性群體中的累積個人識別率(CDP)分別為1～6.9199×10-18和1～5.4584×10-11、1～7.1551×10-18和1～6.1816×10-11、1～5.4507×10-18和1～4.8230×10-11，在漢、仡佬、苗族三聯體和二聯體中的累積平均非父排除率(MEC)分別為0.999 999 999 3696和0.999 999 5255、0.999 999 999 3699和0.999 999 5412、0.999 999 999 4723和0.999 999 5994。系統效能達到了法醫DNA檢驗的要求，是一組理想的X-STR遺傳標記，能為疑難親緣鑒定案件的鑒定提供有效的手段，在法醫學鑒定中有較高的應用價值。

綜上所述，本研究獲得了中國漢、仡佬和苗族群體19個X-STR基因座的等位基因頻率分布數據，為建立這3個民族群體X-STR分布數據庫、法醫學應用及遺傳關系的分析提供了良好的遺傳背景數據。