交感神經興奮與樹突狀細胞活化加劇脂多糖誘導大鼠心肌損傷

劉安雷，劉聚源，徐　軍，劉繼海， 朱華棟，于學忠*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 急診科, 北京 100730;2.北京醫院 醫院感染管理處, 北京 100730)

膿毒癥是機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙，有多種免疫細胞參與，包括巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cell,DC) 和NK細胞等發生激活、凋亡或自噬，從而破壞了機體正常的免疫應答，加重膿毒癥患者的病情[1]。隨著病情發展，常伴有過度的交感神經系統激活，兒茶酚胺大量釋放導致的心肌損傷。心率加快加重了心肌負荷和耗氧量，可能在心肌損傷過程中發揮作用[2]。但上述理論在膿毒癥心肌損傷中的作用研究甚少，本研究旨在探究脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致大鼠交感神經系統過度興奮及DC活化與心肌損傷之間關系，探究膿毒癥心肌損傷相關的發病機制，為臨床治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料

3%戊巴比妥鈉、注射用硝普鈉、重酒石酸去甲腎上腺素標準品和LPS (Sigma-Aldrich公司);抗體及抑制劑(Santa Cruz公司);實驗動物：40只SPF級7～8周齡雄性SD大鼠，質量：180～200 g [北京維通利華試驗動物技術有限公司,SCXK(京)2016-0011]。

1.2　方法

1.2.1動物分組及模型構建：將動物隨機分為4組：對照組、LPS組(腹腔注射LPS 10 mg/kg)、阿替洛爾(Ate)干預組(用LPS造模后給予β受體阻斷劑阿替洛爾5 mg/kg)和DC抑制劑VAG539干預組(LPS造模后給予VGA539 30 mg/kg灌胃每天2次，共2 d)。

1.2.2血流動力學指標：腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉大鼠，行頸總動脈插管至左心室，記錄血流動力學指標。

1.2.3HPLC測定血漿乙酰膽堿(NE)含量：經腹主動脈使用肝素抗凝負壓管采血3 mL，3 200 r/min離心10 min，取上清液存于-80 ℃冰箱備用。取大鼠血漿0.5 mL與等體積0.4 mol/L HClO4溶液混合，4 ℃ 15 000 r/ min，離心10 min，取上清液待測。Irregular2HC18色譜柱，流速0.3 mL/min，玻璃碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，工作電壓+0.75 V，流動相為0.1 mol/L NaH2PO4-甲醇-0.01 mol/L EDTA-0.2 mol/L辛基磺酸鈉溶液(87∶15∶1∶2.5, pH 3.9)。用倍數稀釋法將濃度為5 mmol/L的標準NE樣品梯度稀釋，分別加20 μL樣品至HPLC中，如果樣品中的某一成分峰的保留時間與標準NE樣品相應峰的保留時間相一致，即以此作為樣品NE峰的依據，使用HPLC軟件計算樣品NE含量。

1.2.4免疫組化法檢測心肌中TNF-α和DC的含量(SABC法)：3 μm石蠟切片常規脫蠟，封閉內源性過氧化酶，應用微波暴露抗原后封閉內源性生物素，分別加羊抗鼠TNF-α單克隆抗體(1∶250)和鼠抗鼠CD86單克隆抗體(1∶200)，37 ℃孵育2 h，加辣根過氧化物酶標記的羊抗羊IgG，37 ℃孵育30 min，滴加SABC，37 ℃孵育30 min，滴加DAB顯色液，蘇木素復染，脫水，透明，封片。隨機取每組心臟組織各3張切片，每張隨機4個視野，共12個視野，計數其中陽性染色的血管數目進行比較。

1.2.5檢測腎交感神經放電：用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠，常規分離腎交感神經，連接Powerlab多導生理儀記錄放電過程，比較各組交感神經放電情況。

1.3　統計學分析

2　結果

2.1　心率、LVEDP及±dp/dtmax的變化

與對照組相比，經LPS誘導24 h的3組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)增大(P<0.05)，左室壓力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)降低(P<0.05)，心率加快(P<0.05)。早期給予Ate或VAG539后,與LPS組相比，上述血流動力學指標有所改善(P<0.05)(表1)。

表1　血流動力學指標

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with LPS.

2.2　血漿NE水平

與對照組相比，LPS誘導24 h的3組大鼠血漿NE水平升高(P<0.05)。給予Ate后，與LPS組比較NE水平降低(P<0.05)。VAG539組與LPS組相比，NE水平也明顯降低(P<0.05)(表2)。

表2　血漿NE濃度Table 2　Concentration of NE in n=10)

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with LPS.

2.3　心肌細胞TNF-α含量的變化

LPS組大鼠心肌TNF-α水平較對照組升高(P<0.05)。給予VAG539可明顯降低TNF-α浸潤(P<0.05)。Ate組心肌細胞TNF-α浸潤水平明顯降低(P<0.05)(圖1,2)。

圖1　各組大鼠心臟組織TNF-α表達情況Fig 1　Expression of TNF-α in heart tissue in each group rats by immunohistochemistry

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with LPS圖2　大鼠心臟組織TNF-α免疫組化陽性數Fig 2　Numbers of TNF-α positive cells in heart tissue in rats by

2.4　心肌細胞DC含量的變化

Ate組心肌細胞DC含量較對照組明顯升高(P<0.05)。VAG539組與LPS組相比明顯降低(P<0.05)，Ate組與LPS組相比也有明顯降低(P<0.05)(圖3,4)。

圖3　各組大鼠心臟組織DCs表達情況Fig 3　Expression of DCs in heart tissue in each group rats by immunohistochemistry

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with LPS圖4　大鼠心臟組織DCs免疫組化陽性數Fig 4　Numbers of DCs in heart tissue in rats

2.5　大鼠腎交感神經放電活動的變化

與對照組比較，LPS誘導的大鼠腎交感神經放電活動明顯增加(P<0.05)，給予Ate或VAG539后明顯降低(P<0.05) (圖5,6)。

圖5　大鼠腎交感放電情況Fig 5　Renal sympathetic discharges in rats

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with LPS圖6　大鼠腎交感神經活性Fig 6　Renal sympathetic nervous activation in rats

3　討論

膿毒癥是機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙[2，6]。膿毒癥時，TNF-α等促炎細胞因子及NE等血管活性物質釋放[3]，導致補體系統的激活、凝血、毛細血管滲漏和血管擴張，繼發器官衰竭[4]。其中心肌損傷和心功能障礙是常見并發癥，盡早控制心功能障礙是治療的關鍵[5]。

DC是機體內最強的抗原呈遞細胞，在免疫系統中起著橋梁作用，通過抗原呈遞致免疫細胞活化、抑制甚至凋亡。此外，DC在動脈粥樣硬化(AS)、心肌炎、心肌缺血/再灌注損傷及心肌梗死中也發揮重要作用[6]。

交感神經功能活動受下丘腦-室旁核-腎上腺軸(HPA軸)的調節，是重要的神經內分泌調節系統。當外周發生炎性改變時，PGE2大量合成，并穿過血腦屏障進入中樞，引起室旁核區促腎上腺皮質激素釋放激素陽性神經元活性增強，經HPA軸引起交感神經活動增強[7-8]。電刺激清醒大鼠頸動脈竇神經可通過化學受體激活減輕清醒大鼠對LPS的天然免疫反應，降低血漿中炎性細胞因子水平[7]，表明神經系統與免疫系統之間存在相互影響[9-10]。交感神經興奮可使心率加快，心臟做功增加，在膿毒癥治療早期可通過升高血壓起到代償作用[2]。但隨著疾病的進展，交感神經持續興奮會使心率持續增快，心臟不能完全舒張，有效心輸出量降低，冠脈灌注不足，反而會加重心肌損傷。

本研究通過使用β受體阻滯劑Ate抑制LPS致大鼠心肌交感興奮及VAG-539抑制(水溶性免疫抑制劑，可抑制DC成熟活化[11])DC活性，均可以改善LPS誘導大鼠心肌炎性反應及功能障礙，作用機制可能與降低交感興奮性后心肌炎性因子表達下調，炎性浸潤改善，從而減輕心肌損傷有關。此外，早期抑制DC激活，不但可以降低心肌炎性浸潤，同時可記錄到交感興奮產物NE水平降低，交感放電減弱，表明二者都是加劇LPS致心肌損傷的原因。

綜上，本研究表明交感神經系統過度興奮及DC活化加劇了脂多糖誘導大鼠心肌損傷，為深入研究LPS致心肌損傷機制提供了理論基礎。