咖啡鞣酸抑制HSV- 1感染的小膠質(zhì)細(xì)胞系的炎性反應(yīng)

鄧　娜，王金堂

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 兒童醫(yī)療中心, 湖北 十堰 442000)

單純皰疹病毒性腦炎(herpes simplex encephalitis,HSE)是最常見(jiàn)的、病死率最高的腦炎[1- 2]。它的年發(fā)病率約為2～4/100萬(wàn)，90%的病例是由單純皰疹病毒1型(HSV- 1型)引起的[2- 3]。綠原酸(chloro-genic acid, CGA)是生物合成奎寧酸和咖啡酸的重要中間產(chǎn)物[4]。研究顯示， CGA具有較強(qiáng)抗HSV病毒導(dǎo)致的腦炎、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤、止痛和退熱等作用[5- 6]； 雖然綠原酸具有抗炎作用，但目前還不清楚CGA是否在HSE中具有抗炎作用。還沒(méi)有關(guān)于在HSE模型中使用CGA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。本研究的目的是確認(rèn)CGA是否可以抑制HSE中的炎性細(xì)胞因子。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試劑:咖啡鞣酸(≥95%滴定)、甲基噻唑基四唑(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma-Aldrich公司)。細(xì)胞因子IL- 6和TNF-α的ELISA試劑盒(Neobioscience公司)。 RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司)。

1.1.2BV2細(xì)胞：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))。

1.1.3病毒：HSV- 1(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院病毒室)。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞及病毒的培養(yǎng)及細(xì)胞的分組處理：用含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)BV2細(xì)胞3 h。 間隔2～3 d，更換上清液，或傳代細(xì)胞。將HSV- 1與Vero細(xì)胞共培養(yǎng); 病毒在Vero細(xì)胞單層上至產(chǎn)生完全細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect， CPE)。 當(dāng)超過(guò)90%的細(xì)胞顯示出CPE時(shí)，對(duì)感染的燒瓶進(jìn)行2次凍-融循環(huán)。 然后，在9 000×g離心30 min，從感染的Vero細(xì)胞中收集含HSV- 1病毒的上清液。為了確定HSV- 1感染細(xì)胞的滴度，用不同稀釋度的HSV- 1上清液感染BV2細(xì)胞。觀察36 h后的CPE，并使用Reed-Muench方法計(jì)算50%細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量(CCID50)。 細(xì)胞模型的建立和干預(yù)：將細(xì)胞分為對(duì)照組、HSV- 1病毒組[處理方法：分別在6孔板、12孔板或96孔板中傳代培養(yǎng)24 h至70%匯合度，除去細(xì)胞上清液，向除正常對(duì)照組外的孔中加入HSV- 1病毒(100 CCID50,10-2/0.1 mL)]和CGA 100 ng/mL、50 ng/mL和25 ng/mL干預(yù)組(處理方法：6 h后更換上清液，將CGA在DMEM培養(yǎng)基中分別稀釋至100 ng/mL、50 ng/mL和25 ng/mL的濃度來(lái)干擾HSV- 1細(xì)胞模型)。24 h后，分別收集上清液和細(xì)胞用于ELISA和實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)。用HSV- 1刺激后無(wú)任何干預(yù)措施的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，而僅僅用DMEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞作為正常對(duì)照組。

1.2.2CGA的細(xì)胞毒效應(yīng)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察:MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。在用CGA處理24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)。準(zhǔn)備好刺激所用的病毒和干預(yù)所用的CGA，并向每個(gè)孔中加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，然后在37℃下孵育4 h后檢測(cè)。然后，小心地除去孔中的培養(yǎng)物上清液，并將200 μL的DMSO加入到每個(gè)孔中，將培養(yǎng)板振蕩10 min以完全溶解晶體。使用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的A值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.2.3用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNF-α、IL- 6 mRNA表達(dá):根據(jù)試劑說(shuō)明用RNAiso Plus提取BV2細(xì)胞中的總RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒在37 ℃下反應(yīng)15 min和85 ℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用StepOne Plus(Applied Biosystems 公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒的說(shuō)明書(shū)，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s 40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法進(jìn)行分析。所有引物均由GenScript公司合成，TNF-α上游引物：5′-GACGTGGAACTGG CAGAAGAG-3′，下游引物:5′-TGCCACAAGCAGGAA TGAGA-3′；IL- 6上游引物:5′-ACCTG GTAGAAGT GATGCCCCAGGCA-3′，下游引物:5′-C TATGCAGTT GATGAAGATGTCAAA-3′；GAPDH上游引物:5′-AG AGAAGGACACTGAGCAAGA-3′，下游引物:5′-GCC CCTCCTGTTATTATGGGG-3′。

1.2.4ELISA檢測(cè)上清液中TNF-α和IL- 6含量:按說(shuō)明書(shū)操作，病毒刺激24 h后，用CGA處理BV2細(xì)胞，收集上清液，ELISA檢測(cè)TN F-α和IL- 6的表達(dá)量。取六孔板細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL離心管中，12 000 r/min 離心 5 min 收集上清液，凍存于-20 ℃。檢測(cè)前提前 20 min 從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1∶20)。標(biāo)準(zhǔn)品的配制:加入標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液 1.0 mL 至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，待徹底溶解后，靜置15 min并混勻(濃度2 000 pg/mL)。倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液:1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625和0 pg/mL。生物素化抗體工作液的配制:以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1∶100)。酶結(jié)合物工作液的配制:以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1∶100)。從己平衡至室溫的密封袋中取出所需板條。除空白孔外，分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)及標(biāo)本加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫箱孵育 90 min。手工洗板 4 次，甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液 350 μL，靜置 30 s后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。除空白孔外，每孔加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫箱孵育60 min。手工洗板4次。除空白孔外，每孔加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育 30 min。手工洗板4次。加入顯色劑 100 μL/孔，避光 37 ℃溫箱孵育 15 min。加入終止液 100 μL/孔，混勻后在 5 min內(nèi)測(cè)量吸光度(A450 nm)OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出濃度。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　病毒感染劑量的測(cè)定

使用不同稀釋倍數(shù)的HSV- 1上清液感染BV2細(xì)胞。 CPE顯示細(xì)胞折射增強(qiáng)，促進(jìn)神經(jīng)突觸形成，細(xì)胞質(zhì)空泡化，以及大量的細(xì)胞死亡。CCID50值為10-4/0.1mL(圖1)。

Compared with normal cells (A), the neurite formation of infected cells (B) increased, vacuolization was observed in cytoplasm, and a large number of cell death was found圖1　HSV- 1(10-1/0.1 mL)感染BV2細(xì)胞12 h后的細(xì)胞病變效應(yīng)Fig 1　Cytopathic effect of BV2 cells infected with HSV- 1 (10-1/0.1 mL) after 12 hours(×100)

2.2　CGA體外細(xì)胞毒性的測(cè)定

用制備好的CGA溶液預(yù)處理未刺激的BV2細(xì)胞24 h未顯著影響細(xì)胞活力。 CEL形態(tài)觀察顯示出相同的結(jié)果。

2.3　CGA對(duì)HSV- 1刺激細(xì)胞存活率的影響

與正常組相比，HSV- 1組具有顯著抑制作用(P<0.01)。與HSV- 1組比較，CGA作用24 h后存活率增加(P<0.05)。此外，CGA濃度為100 ng/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的影響顯著升高(P< 0.01)，顯示出細(xì)胞存活率與CGA劑量之間存在濃度依賴(lài)關(guān)系(圖2)。

Cell activity was performed by MTT assay, and the results indicated that cells accounted for the percentage of normal cells; #P<0.01 compared with control group; *P<0.05, **P<0.01 compared with HSV- 1 group圖2　CGA對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響Fig 2　Effect of CGA on the viability of BV2 cells

2.4　CGA對(duì)HSV- 1刺激的IL- 6和TNF-α的影響

與正常組相比，HSV- 1組中IL- 6(圖3A)和TNF-α(圖3C)的水平增加(P<0.01)，并且隨著加入的CGA濃度增加，IL- 6和TNF-α顯著降低(P<0.05)。CGA降低了HSV- 1刺激的IL- 6(圖3B)和TNF-α(圖3D)mRNA水平，表明CGA在反轉(zhuǎn)錄水平負(fù)向調(diào)節(jié)IL- 6和TNF-α。

A, B.the mRNAs expression levels of IL- 6 and TNF-α ;C, D.cell culture supernatant cytokine levels measured by ELISA;#P<0.05 compared with the normal group；##P<0.01 compared with the normal group;*P<0.05 compared with HSV- 1 group；**P<0.01 compared with the HSV- 1 group

3　討論

HSE是一種急性病毒性腦炎。雖然發(fā)病率不高，但它具有潛在的破壞性。此外，HSE病毒性感染仍然是選擇性的，由病毒激活的炎性免疫應(yīng)答非常重要。

HSV- 1蛋白或病毒核酸被稱(chēng)為病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)，可以結(jié)合TLR，啟動(dòng)炎性反應(yīng)的先天免疫應(yīng)答。 研究表明，通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答在HSE中是關(guān)鍵所在[8]。 TLR2和TLR9已被描述為皰疹病毒科成員的識(shí)別分子。 Myd88依賴(lài)的信號(hào)通路導(dǎo)致NF-κB核易位和NF-κB依賴(lài)基因的激活，參與的促炎細(xì)胞因子基因有TNF-α、IL- 1β、IL- 6和其他應(yīng)激誘導(dǎo)基因[9]。有報(bào)道HSV- 1可以通過(guò)TLR2和TLR9途徑誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[10]。除此之外，TNF-α和IL- 1β在HSV- 1誘導(dǎo)的腦炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷哪X中顯著增加[11]。大多研究表明，由HSV誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和趨化因子可以導(dǎo)致腦炎性反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)，破壞腦功能或引起死亡[12]。與野生型小鼠相比，HSV- 1感染后，TLR2基因敲除的小鼠表現(xiàn)出弱的細(xì)胞因子和趨化因子反應(yīng)，以及低的病死率和炎性腦損傷[13]。這些數(shù)據(jù)表明TLRs啟動(dòng)炎性反應(yīng)過(guò)程，并且由TLRs觸發(fā)的反應(yīng)可能是過(guò)度的，以試圖抵抗病毒的攻擊。

本研究發(fā)現(xiàn)用HSV- 1感染后，小膠質(zhì)細(xì)胞存活率下降，NF-κB反式定位于細(xì)胞核，并且TNF-α和IL- 6的表達(dá)上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明HSV- 1在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中激活NF-κB，并通過(guò)TLR通路增加TNF-α和IL- 6表達(dá)。當(dāng)用CGA來(lái)治療小膠質(zhì)細(xì)胞感染時(shí)，細(xì)胞存活率顯著改善；NF-κB向核的移位被抑制。 TNF-α和IL- 6的表達(dá)也被CGA強(qiáng)烈抑制，減輕炎性反應(yīng)。本究結(jié)果表明，CGA可以抑制HSV- 1誘導(dǎo)腦炎的炎性反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)研究了CGA在抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞因子和趨化因子如TNF-α和IL- 6分泌，從而抑制體外HSV- 1誘導(dǎo)腦炎的炎性反應(yīng)。關(guān)于CGA抗炎機(jī)制的進(jìn)一步研究可能有助于找到預(yù)防和治療HSE的新方法。